【文献解读】源井高效敲除慢病毒助力膀胱癌无创诊断
T1DMR、T2DMR DNA甲基化检测法
背景
膀胱癌(Bladder cancer,BLCA)是泌尿生殖系统最常见的癌症之一,也是全球第十大常见癌症,每年约有549,000例新发病例及约200,000例死亡病例。其中75%的病例被诊断为非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC),其余25%的病例为肌肉浸润性膀胱癌(MIBC),而这两种肿瘤的治疗方法是完全不一样的。因此,在确定治疗方案前,对膀胱癌进行准确分类十分重要。膀胱癌的临床治疗方案的选择依赖于肿瘤分期的准确判定,分期不准确会引入不必要的手术治疗、降低治疗后的生存率,也可能永久性降低患者生活质量。而传统的膀胱癌(BLCA)无创诊断方法敏感性低、特异性低,难以检测早期肿瘤、微小肿瘤、肿瘤残留灶及复发肿瘤,也无法准确区分高级别(HG)和低级别(LG)肿瘤、区分肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)和非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)。
为此,武汉大学中南医院的Wang等人对膀胱癌的整个DNA甲基化(DNAm)的综合表征进行研究。他们发现DNA甲基化是泛癌症特异性标志物的一种,特殊DNA甲基化的检测可用于癌症确诊及亚型精准分类。故对不同肿瘤组织和常规尿液进行全基因组靶向测序,最终发现循环肿瘤DNA甲基化(ctDNAm)的靶向测序可以帮助我们准确区分HG肿瘤和LG肿瘤、区分MIBC和NMIBC,且在复发预测、预后预测方面较基因组突变及荧光原位杂交检测(FISH)更优异,并发表了题为“Non-invasive diagnosis and surveillance of bladder cancer with driver and passenger DNA methylation in a prospective cohort study”的文章。下面就带大家了解具体研究过程。
通过统计学比较不同组织来源的DNAm谱可以得到每个组别的甲基化差异区域(DMR)(见图1 A),研究人员从中选取了T1DMR(癌变前正常细胞甲基化差异区域)及T2DMR(癌变细胞的甲基化差异区域)进行研究。
单个DNA上多个CpG位点发生胞嘧啶甲基化的情况被称之为甲基化单倍型。在癌症肿瘤发生过程中,T1DMR的甲基化单倍型不会发生变化,也不具备致癌能力,而T2DMR的甲基化单倍型会有所变化,且与癌症进程驱动及肿瘤恶化有着密切联系。因此,研究人员将T1DMR称为passenger位点、将T2DMR称为driver位点,并对与膀胱癌有关的17个T1DMR、T2DMR进行了单细胞RNA和ATAC测序。结果表明,LG肿瘤、NMIBC仅与T1DMR的单倍型有关,HG肿瘤及MIBC则与T2DMR单倍型有关(见图1 C)。而对不同肿瘤分类的患者样品单倍型进行统计,发现T2DMR组中的HOXC9、CCN1、MYOM2、SOX2基因甲基化与HG肿瘤发生有着较强关联(见图1 D),HG肿瘤的单倍型多样性较LG高,且HG和LG肿瘤中的T1DMR单倍型并不相同,提示HG肿瘤中存在明显的表观遗传重排现象,HG/MIBC和LG/NMIBC来源于不同细胞。
图 1 膀胱癌差异性甲基化区域分类
上述实验确认了MIBC和NMIBC起源于不同细胞的分化,研究人员对MIBC、NMIBC的细胞(即尿路上皮基底细胞和尿路上皮中层细胞)的SOX2位点相关驱动基因的T2DMR功能进行了验证。
通过ATAC数据库确定SOX2位点附近的调控元件及其染色体可及性,对膀胱癌细胞系T24(来自MIBC供体)、5637(来自MIBC供体)、RT4(来自NMIBC肿瘤)进行CUT&Tag实验,研究转录因子和染色质调控因子与SOX2区域的结合。实验结果表明基底细胞特有的FOXA1与远端调控区(L1或L4)的结合会抑制SOX2和L4的非增强子依赖顺式相互作用,并激活L1增强子的活性,促进L1与SOX2的相互作用(见图2)。
对此,研究人员先使用Cas9慢病毒(由源井生物提供)构建5637-Cas9, RT4-Cas9和T24-Cas9稳转株,然后转导DMR或 SOX2的KO sgRNA慢病毒(由源井生物提供),对上述TM4SF1癌症阳性亚群(TPCS)细胞系的SOX2相关T2DMR区域、SOX2位点进行敲除以研究T2DMR对SOX2表达的调控作用。结果显示,敲除SOX2-T2DMR后,SOX2无法与L1增强子进行相互作用,导致SOX2 RNA表达下降(见图2 C)。而直接敲除SOX2会减弱TPSC细胞系的迁移、侵袭能力(见图 3),对MIBC的侵袭性有重大影响。这些结果都表明T2DMR是膀胱癌SOX2的重要调控元件,其差异性甲基化会驱动癌症从NMIBC向MIBC转变,提示T2DMR甲基化差异或能成为MIBC与NMIBC分类依据。
图 2. 驱动因子T2DMR与癌基因增强子相互作用以调控其功能
图 3 SOX2对MIBC的侵袭性至关重要
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采用EUCAS法对MIBC、NMIBC组织进行测序,并根据流行率绘制T1DMR、T2DMR DNAm单倍型热图(见图4 A)。热图显示,DMR单倍型的流行率可以将BLCA样品进行清晰的HG/LG分类,且HG组中不仅有致癌基因突变还有抑癌基因突变(TP53、CDKN、SOX),而LG组中仅有致癌基因突变(见图4 A)。构建模型进行预测发现T1DMR和T2DMR的DNA甲基化检测可以准确反映肿瘤生物学潜在病理、临床特征,用于MIBC、NMIBC的精确分类(见图4B)。
图 4 对DMR甲基化检测法的评估
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随后作者对是否可以在尿液中识别癌症相关甲基化特征进行了验证,发现肿瘤载量与尿液中的DNAm信号呈正相关,并开发了一种BLCA无创检测方法——通过对尿液样品中DNAm单倍型进行多重PCR NGS测序以便予肿瘤进行预测评分(UCAS)。作者对该方法与传统BLCA无创检测方法进行了比较,发现这种新方法有着更高的敏感性及特异性,要优于现有的临床检测方法。
不仅如此,作者还通过对比术前术后临床病理结果及UCAS检测结果证实了UCAS对HG/LG、MIBC/NMIBC分类预测的准确性,及UCAS用于术后残留灶检测及复发预测的可行性与准确性。
该研究确定了肿瘤特异性DMR上的DNA甲基化作为膀胱癌无创检测、监测的生物标志物的效用,开创了一种分类更为准确的膀胱癌无创检测方法,有望为膀胱癌临床治疗提供更便捷、更精准的肿瘤分期判断,为膀胱癌治疗预后提供保障!
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参考文献:
Xiao, Yu et al. “Non-invasive diagnosis and surveillance of bladder cancer with driver and passenger DNA methylation in a prospective cohort study.” Clinical and translational medicine vol. 12,8 (2022): e1008. doi:10.1002/ctm2.1008