源井点突变细胞助力发现：SF3B1突变通过circATP9B瓦解核肌动蛋白抑制 DNA 修复
引言
SF3B1 是骨髓增生异常综合征、血液及多种实体瘤高频突变的剪接因子，突变会造成同源重组修复缺陷，使肿瘤对 PARP 抑制剂敏感，但背后完整分子机制尚不清晰。吉林大学中日联谊医院钱睿等人于 Cell Death & Disease 发表最新研究，研究发现 SF3B1 热点 K700E 突变会上调 circATP9B，而该环状 RNA 可介导 MYH9 泛素化降解，破坏核肌动蛋白网络组装，阻碍 DNA 双链断裂移位聚集、抑制同源重组修复； 细胞与体内实验证实下调 circATP9B 或回补 MYH9 可逆转修复缺陷，为 SF3B1 突变型肿瘤使用 PARP 抑制剂提供全新分子机制解释与理论支撑。该研究中的关键细胞工具 K562 SF3B1-K700E 突变细胞株由源井生物提供。
研究背景
SF3B1是RNA剪接复合体U2 snRNP的重要组成因子，参与对pre-mRNA中内含子3’端剪接位点的识别和剪接。SF3B1在多种癌症中具有高频率的突变，并导致内含子3’端选择性剪接事件显著增多。大量研究表明，一些由SF3B1突变导致的pre-mRNA异常剪接通过改变在癌症相关通路中发挥关键作用的基因的表达促进癌症发展。携带有SF3B1突变的细胞具有DNA同源重组修复缺陷的特征，但SF3B1突变造成DNA损伤修复缺陷的分子机制尚未完全明确。
Circular RNA(circRNA)作为一种呈共价闭合环状结构的RNA分子，主要通过下游内含子的5’剪接位点与上游内含子的3’剪接位点之间的反向剪接生成，而反向剪接的完成依赖于包括U2 snRNP在内的RNA剪接体复合体。SF3B1表达降低导致细胞中circRNA的表达发生改变。有研究显示携带有SF3B1突变的骨髓异常增生综合征病人样本中有些circRNA的表达也发生改变。然而，关于SF3B1突变如何干扰circRNA表达的系统性研究尚未见报道。
主要结果
为了深入探究SF3B1如何改变circRNA的表达，作者对带有SF3B1的细胞进行了高通量测序分析，测序数据显示在 多株细胞系中SF3B1突变均可导致circRNA的表达发生改变， 其中大部分表达发生改变的circRNA呈现细胞系特异性。然而，在不同的细胞系中，SF3B1均可导致circATP9B表达水平显著上升。对前人测序数据库的分析表明，circATP9B在携带有SF3B1突变的骨髓异常增生综合征病人样本中也存在高表达。SF3B1突变不影响ATP9B pre-mRNA和mRNA的表达水平，表明SF3B1突变是通过反向剪接促进circATP9B的生成，而荧光原位杂交等实验显示 circATP9B主要定位于细胞质中。
图1. circATP9B的鉴定与表征
为探究circATP9B的作用，作者通过质谱检测了与circATP9B结合的蛋白，结果显示 circATP9B与MYH9蛋白间存在显著的相互作用。 过表达circATP9B导致MYH9蛋白的表达水平降低，但并不影响MYH9 mRNA的表达水平，表明circATP9B是在转录后水平上调控MYH9蛋白的表达。进一步实验结果显示，过表达circATP9B导致MYH9蛋白稳定性降低和泛素化水平显著上升，说明 circATP9B通过介导MYH9蛋白的泛素化促进其降解。
图2. CircATP9B通过泛素-蛋白酶体途径促进MYH9的降解
MYH9作为非肌肉肌凝蛋白家族的一员，主要通过参与形成肌动蛋白丝而维持细胞的形态和运动能力。近年来有研究表明，在DNA发生双链断裂时，肌动蛋白丝在细胞核内的DNA损伤位点形成并促进损伤位点的移动和聚集，从而提高DNA损伤修复的准确性和效率。由此，作者探究了MYH9在DNA损伤修复和核肌动蛋白丝的形成中的作用。在经放射线处理诱导DNA损伤的细胞中，敲低MYH9抑制DNA损伤位点的修复，而且敲低MYH9的细胞对DNA损伤修复抑制剂Olaparib更敏感，说明MYH9的敲低造成DNA损伤修复的缺陷。活细胞成像显示敲低MYH9导致在DNA发生损伤时核肌动蛋白丝的组装受到阻碍， DSBs的移动和聚集能力也受到明显抑制，说明MYH9通过参与细胞核中肌动蛋白丝的组装调节DSBs的移动和聚集。这一系列实验结果表明 MYH9通过参与核肌动蛋白丝的组装促进DNA损伤修复。
图3. MYH9调控双链断裂（DSB）位点的移动与聚集。
过表达circATP9B对肌动蛋白丝组装和DNA损伤修复具有抑制作用，而在过表达circATP9B的细胞中回补MYH9的表达解除了这些抑制作用，表明circATP9B通过促进MYH9的降解而抑制DNA损伤修复。裸鼠植瘤实验结果显示Olaparib处理可显著抑制过表达circATP9B肿瘤细胞的生长，同样表明circATP9B抑制DNA损伤修复。敲低circATP9B可缓解SF3B1突变对核肌动蛋白丝组装的抑制作用，且提高了携带SF3B1突变的细胞中DSBs的移动和聚集能力，进而改善了携带SF3B1突变的细胞中受损DNA的修复，说明 circATP9B介导了SF3B1突变对DNA损伤修复的抑制。
图4.CircATP9B基因敲低可缓解由SF3B1突变引起的DNA修复缺陷
文章小结
本研究通过多组学筛选、分子互作、活细胞动态示踪与体内模型证实，肿瘤热点 SF3B1-K700E 突变会上调 circATP9B，circATP9B 结合并促进 MYH9 泛素化降解；MYH9 缺失破坏核肌动蛋白网络组装，阻碍异染色质双链断裂的移位与聚集，抑制同源重组修复，造成基因组不稳定；抑制 circATP9B 或回补 MYH9 可逆转该修复缺陷，且 circATP9B 高表达会增强肿瘤对 PARP 抑制剂的敏感性。 研究揭示了 SF3B1 突变驱动肿瘤进展的非经典 circRNA 介导通路，为携带 SF3B1 突变恶性肿瘤的靶向治疗提供新思路。
图5.研究机制
源井生物提供的支持
在该研究中，源井生物提供的SF3B1突变的K562细胞模型为揭示 SF3B1 突变驱动肿瘤进展的非经典 circRNA 介导通路发挥了重要作用。
源井生物依托自主研发 EZ-editor™基因编辑平台，重磅迭代推出全新一代精准编辑系统 ——EZ-HRex™技术。经全面技术优化升级，该体系可大幅提升细胞点突变、长片段定点敲入的 HDR 同源重组效率，转染后细胞池（Cell Pool）阳性 HDR 基因型占比最高可达 84%。
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