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干货|轻松搞定MDA-MB-231细胞培养和基因编辑！
MDA-MB-231细胞系源自一名53岁女性乳腺癌患者，广泛应用于乳腺癌转移机制和肿瘤微环境研究。其高迁移性和侵袭性使其成为抗癌药物筛选和肿瘤转移研究的重要工具。
然而，想要高效地培养和编辑MDA-MB-231细胞，可能面临着不少挑战，例如细胞增殖速度快、培养条件要求高、基因编辑效率相对较低，这些都可能影响实验的顺利进行。今天，小源和大家一起来了解如何培养好MDA-MB-231细胞，并掌握基因编辑的小Tips吧！
细胞信息
细胞名称 | MDA-MB-231（人乳腺癌细胞） |
细胞形态 | 上皮样，贴壁细胞，大部分为纺锤状，也有部分细胞呈圆形 |
细胞培养条件 | L-15＋10%FBS＋1%P/S(推荐使用源井优化的培养基) |
气相：空气，95% 注意：L-15培养基不需要CO2作为缓存，如用5%CO2、37℃的细胞培养箱培养则需密闭培养。 | |
温度：37℃ | |
换液频次 | 2-3次/周 |
传代比例 | 1:2-1:3 |
图1 MDA-MB-231细胞生长正常
细胞呈上皮样，多数细胞呈纺锤状，少数细胞呈圆形，培养过程中细胞胞体上有黑点属于正常现象
图2 MDA-MB-231细胞生长状态差
细胞形态发生改变，细胞老化(如红框所示)，如细胞失去其原有的纺锤状或圆形形态，变得不规则或皱
MDA-MB-231细胞培养
1.细胞复苏
1) 准备：取7mL完全培养基于离心管中备用；
2) 解冻：将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴；
3) 离心：将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液；
4) 重悬与接种：用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养瓶中；
5) 培养：将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况。
2.细胞传代（以T25瓶为例）：
1) 当细胞汇合度达到80-90%时可进行传代，传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次；
2) 加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育 1-2分钟，待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化；
3) 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化，然后转移至15mL离心管中；
4) 1100 rpm 室温离心 4 分钟，离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞；
5) 细胞按照1:2-1:3比例传代，传代第二天观察细胞状态。
3.细胞冻存：
1) 收集细胞：按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中
2) 离心：1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清；
3) 重悬与冻存：用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息；
4) 降温与储存：将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存。
细胞培养FAQ
细胞状态差如何调整？
1. 培养基和血清：确保使用正确的基础培养基和加入适量血清，血清浓度可根据细胞状态适当调整。
2. 细胞培养环境：确认培养温度、湿度、气相条件是否正常。
3. 避免使用过期或长时间存放的培养基，新鲜配制的完全培养基建议在两周内使用完毕。
4. 细胞传代操作：细胞传代时，注意消化时间和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤。
细胞老化如何调整？
1. 确认培养条件以及培养环境是否正确。
2. 避免胰酶消化过度：合适的胰酶浓度和消化时间，避免用力吹打，造成细胞损伤。
3. 增加血清浓度/选择高质量胎牛血清。
4. 调整细胞密度：细胞密度过高会导致营养不足和代谢废物积累，从而加速细胞老化，应将细胞密度控制在适宜范围内。
5. 添加生长因子，可以促进细胞增殖和分化，有助于改善细胞老化状态。
6. 换低代次细胞。
7. 通过挑选单克隆等方法，从老化的细胞群体中筛选出具有生长优势的单克隆细胞，进行纯化培养。
细胞基因编辑Tips
MDA-MB-231细胞转染时注意事项：
1. 确保细胞状态良好，细胞处于对数生长期，细胞密度一般处在80-90%。
2. 注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害。
3. 实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团。
4. 细胞进行实验时活率≥80%。
慢病毒需注意：
1. 进行实验时要控制好感染前的细胞汇合度30-40%之间，不可过高。
2.正式实验前可进行预实验找到最合适的MOI;感染前添加助染剂Polybrene。
3.转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性。
图3 慢病毒感染MDA-MB-231细胞
电转法需注意：
1.进行实验时控制好电转细胞量，电转后接种到合适的培养板里。
2.要保证电转后细胞贴壁率≥70%。
3.进行转染时需控制好实验时间，电转全程不宜过长。
MDA-MB-231铺单克隆实验注意事项：
1. 确保铺克隆实验前细胞状态正常，老化细胞少，建议控制细胞汇合度在70%左右。
2. 铺克隆时细胞活率≥85%。
3. 可先进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低。
4. 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间。
图4 MDA-MB-231细胞单克隆
