CRISPR 文库体内筛选：肿瘤、治疗与免疫靶点的系统发现

在精准医疗的浪潮中，靶点筛选是药物研发的起点，而 CRISPR文库技术 正引领这一领域的革命性突破。当CRISPR文库从体外走向体内，我们获得的不仅是更真实的生物环境，更是能直接指导临床转化的精准靶点。今天，就跟着小源一起探索CRISPR文库体内筛选的无限可能。

为什么需要体内筛选？

体外筛选虽可快速获得初步结果，但无法准确模拟体内复杂的微环境与生理过程。CRISPR文库体内筛选通过将基因编辑细胞直接植入活体生物体，能够更真实地模拟肿瘤微环境、免疫应答及药物代谢等关键生理过程，从而筛选出在体内环境下具有功能的靶点，为药物研发提供更具临床相关性的方向。

体内筛选能用于筛选什么靶点？

1.肿瘤转移靶点

肿瘤转移是癌症致死的主要原因，体内筛选可精准识别促进转移的关键分子机制。例如，在乳腺癌转移研究中，研究者利用全基因组激活文库进行体内筛选，发现核糖体蛋白表达失调及翻译过程异常是促进乳腺癌转移的关键因素。

图1 全基因组激活文库筛选肿瘤转移靶点[1]

研究案例： 研究者构建全基因组激活文库细胞系，通过尾静脉注射将Brx-82和Brx-142两株细胞接种至NSG小鼠体内，通过活体成像监测肿瘤细胞迁移与增殖。结果显示，接种2个月后肿瘤成功转移至肺部并增殖。对肺转移肿瘤细胞进行NGS测序分析后，发现RPL15的过表达显著增强肿瘤细胞的转移能力，并选择性促进其他核糖体蛋白和细胞周期调节因子的翻译过程。

2.肿瘤细胞治疗靶点

肿瘤细胞在体内的增殖受肿瘤微环境、个体差异等多种因素影响。将体外筛选策略转移至体内环境，通过在小鼠成瘤后随机分组并进行特定处理，可发掘在体内真正有效的治疗靶点。

图2 全基因组敲除文库筛选肿瘤治疗靶点[2]

研究案例： 研究者使用胶质母细胞瘤LN229细胞构建全基因组敲除文库，接种至裸鼠后随机分为实验组与对照组，实验组接受辐照处理2周。对两组肿瘤组织进行NGS测序分析并与RNA-Seq结果整合分析，发现谷胱甘肽合成酶(GSS)基因在筛选中显著富集，提示其可能通过调控铁死亡途径影响肿瘤细胞的放射抵抗性。

3.免疫相关靶点

肿瘤细胞免疫逃逸是导致癌症进展和治疗失败的关键因素。CRISPR文库体内筛选能够模拟真实的免疫微环境，发现影响肿瘤免疫逃逸的关键调控因子。

图3 定制文库筛选免疫相关靶点[3]

图4 二次筛选确认Cop1是潜在免疫作用靶点[3]

研究案例： 研究者设计包含4500个与肿瘤发生、发展及免疫调节相关基因的敲除文库，转导至过表达卵清蛋白的4T1-Ova细胞后，分别接种至T细胞免疫缺陷的balb/c裸鼠、免疫功能正常的balb/c小鼠及预先接种卵清蛋白（免疫功能增强）的balb/c小鼠。约2周后收集各组肿瘤组织进行NGS测序分析，获得79个显著富集基因，并通过二次体内筛选确定COP1基因富集程度最高。通过后续功能验证，发现COP1通过调节肿瘤微环境中趋化因子的分泌和巨噬细胞浸润，成为改善三阴性乳腺癌免疫治疗疗效的关键靶点。

体内筛选的优势与挑战

优势:

• 更真实模拟体内生理环境： 筛选结果具有更高的临床相关性
• 系统评估多环节功能： 可全面评估基因在肿瘤发生、转移和免疫逃逸等多环节中的作用
• 提供精准靶点： 为药物研发提供更可靠的靶点，有效缩短研发周期

挑战：

• 实验周期较长： 相较于体外筛选，体内实验周期显著延长，需专业动物实验平台与技术人员支持
• 个体差异影响： 小鼠个体差异较大，实验重复性低于体外筛选，需增加样本量和实验组别以确保结果可靠性
• 实验成本较高： 体内筛选所需成本远高于体外筛选

源井生物提供CRISPR体内筛选服务

CRISPR文库体内筛选虽能做到还原体内真实环境，提供更可靠的靶点，但也需要专业团队的技术支持。选择高质量的文库构建、精确的动物模型和专业的数据分析，才能确保筛选结果的可靠性。源井生物具备完善的预实验摸索和质量管理体系，能够提供全流程 CRISPR文库体内筛选一站式服务, 轻松衔接各个流程节点。更有自主开发的 iScreenAnlys™文库分析平台 ，免费解锁智能分析， Drug-Z、MAGeCK-RRA、MLE 三大算法自由选择，只需上传测序数据，自动完成数据分析。

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参考文献

[1]Ebright RY, Lee S, Wittner BS, Niederhoffer KL, Nicholson BT, Bardia A, Truesdell S, Wiley DF, Wesley B, Li S, Mai A, Aceto N, Vincent-Jordan N, Szabolcs A, Chirn B, Kreuzer J, Comaills V, Kalinich M, Haas W, Ting DT, Toner M, Vasudevan S, Haber DA, Maheswaran S, Micalizzi DS. Deregulation of ribosomal protein expression and translation promotes breast cancer metastasis. Science. 2020 Mar 27;367(6485):1468-1473.
[2]Liu X, Cao Z, Wang W, Zou C, Wang Y, Pan L, Jia B, Zhang K, Zhang W, Li W, Hao Q, Zhang Y, Zhang W, Xue X, Lin W, Li M, Gu J. Engineered Extracellular Vesicle-Delivered CRISPR/Cas9 for Radiotherapy Sensitization of Glioblastoma. ACS Nano. 2023 Sep 12;17(17):16432-16447.
[3]Wang X, Tokheim C, Gu SS, Wang B, Tang Q, Li Y, Traugh N, Zeng Z, Zhang Y, Li Z, Zhang B, Fu J, Xiao T, Li W, Meyer CA, Chu J, Jiang P, Cejas P, Lim K, Long H, Brown M, Liu XS. In vivo CRISPR screens identify the E3 ligase Cop1 as a modulator of macrophage infiltration and cancer immunotherapy target. Cell. 2021 Oct 14;184(21):5357-5374.e22.