HUVEC细胞系结合CRISPR-Cas9基因编辑竟然这么好用!

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发布日期:2024年03月22日
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快来看人类脐带静脉内皮细胞HUVECCRISPR-Cas9基因编辑的默契配合

摘要:人类脐带静脉内皮细胞HUVEC与CRISPR-Cas9基因编辑的配合,带你打开血管生物学、心血管疾病等研究领域的大门。

人类脐带静脉内皮细胞Human Umbilical Vein Endothelial Cells,简称HUVEC)最1970年代成功分离并应用于血管生物学和相关领域的研究。[1]。自那时起,HUVEC细胞系已成为心血管疾病、血管生物学以及人体支架等研究领域中不可或缺的重要细胞模型。随着基因编辑技术尤其是CRISPR-Cas9技术的发展,越来越多研究者使用该技术深入探索细胞的分子机制、疾病发生机理以及新的治疗方法。然而,基因编辑技术难以直接应用于原代细胞,因为原代细胞寿命有限、转染效率低且难以形成单克隆[2]。因此,在许多细胞基因编辑实验中,研究者会选择使用永生化细胞系。那么永生化HUVEC细胞系结合基因编辑技术可以做什么研究呢?接下来小源来带你一探究竟!

HUVEC显微镜观察(40X)[3]

1 HUVEC显微镜观察40X[3]

1.PECAM-1细胞质结构功能研究PECAM-1 Cytoplasmic Structure 

血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)是一种I型跨膜糖蛋白,主要聚集在内皮细胞的细胞间连接处,可以促进白细胞跨内皮迁移、感知剪切和流动变化,并维持血管屏障通透性。PECAM-1胞外结构域嗜同种相互作用可以帮助其行使以上功能,但对其细胞质结构域在这些过程中的作用了解甚少。Liao等人[4]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术用于永生化HUVEC细胞系,成功获得仅敲除PECAM-1细胞质结构域的HUVEC细胞系(ΔCD-PECAM-1)。通过细胞阻抗传感器(EICS)监测内皮细胞屏障的微小变化,他们观察到ΔCD-PECAM-1在内皮细胞连接处正常聚集。在使用凝血酶破坏细胞屏障后,这些细胞能更快地恢复屏障功能。通过荧光漂白后恢复技术(FRAP)评估了分子迁移率,结果显示 ΔCD-PECAM-1 在质膜平面内表现出更高的迁移率,加速重新聚集在内皮细胞边界以调节血管通透性。以上研究结果揭示了 PECAM-1 在质膜平面内自由移动能力受其细胞质结构域的调控,从而影响内皮细胞建立和维持血管通透性屏障的效率。这一发现为进一步理解内皮细胞的功能及血管通透性调控提供了重要线索。

PECAM-1 胞质结构域的缺失可增强屏障恢复功能[4]

PECAM-1 胞质结构域的缺失增强屏障恢复功能[4]

2.CCM致病基因调控纤连蛋白研究

脑海绵状血管畸形 (CCM)是一种特征为不规则毛细血管缠结的血管病变,该病是由于KRIT1 (CCM1)CCM2 PDCD10 (CCM3) 基因在7q7p3p染色体上发生突变所致。这些基因突变破坏了细胞内皮之间的连结,并导致小血管渗透性的改变,从而引起血管畸形。   Schwefel等人[5]利用CRISPR-Cas9技术敲除永生化HUVEC细胞中的CCM1CCM2CCM3基因。作者发现,当HUVEC细胞缺乏CCM1CCM2CCM3基因时,这些细胞会减少纤连蛋白的表达。接着,他们通过添加外源纤连蛋白来观察其对这些缺失基因细胞的影响。研究结果显示,纤连蛋白的加入可以拯救缺少CCM1CCM2CCM3基因的内皮细胞的异常表型,使细胞部分或完全恢复了正常表型。并表明CCM1CCM2CCM3基因对内皮细胞纤连蛋白表达具有重叠的调节作用。

加入纤连蛋白可拯救CCM1或CCM2基因缺失细胞的异常表型[5]

加入纤连蛋白可拯救CCM1CCM2基因缺失细胞的异常表型[5]

3.实时监测E-选择素表达工具开发

E-选择素是一种内皮细胞上表达的糖蛋白在炎症等许多病理过程中具有重要作用Ogrodzinski Lydia及其团队[6]利用CRISPR Cas9技术和NanoBiT技术开发了一种工具,可实时监测细胞表面E-选择素的表达情况,从而灵敏地探测不同炎症细胞因子或配体E-选择素表达的影响。在这项研究中,作者在永生化HUVEC细胞系使CRISPR Cas9技术将HiBiT标签蛋白E-选择素的N端,同时外源加入不能穿过细胞膜的LgBiT蛋白。当LgBiT蛋白与HiBiT标签融合时,会产生光信号,从而实现对E-选择素的荧光检测。结果显示,TNFαIL-1αIL-1βLPSVEGF 165a和组胺等炎症因子或配体诱导后,原代细胞和永生化细胞中E-选择素表达情况相似。此外,作者还评估了这些细胞在生成血管和形成新血管方面的表现。他们发现原代HUVEC永生化HUVECHiBiT-E-选择素-TERT2-HUVE均能够在3D培养基中形成微血。然而,由于原代细胞无法形成单克隆,每次实验都需重新转染以获得表达HiBiT标签-E-选择素的HUVEC细胞。而且基因编辑效率低下导致原代细胞的发光输出减少,易受其他因素的影响。永生化细胞可以使每次实验的发光输出更为一致,因此可以实现对E-选择素更详细的活细胞动力学实时监测将会成为未来炎症药物开发的强有力工具

实时监测E-选择素表达工具示意图[6]

实时监测E-选择素表达工具示意图[6]


从以上的的案例可以看出,永生化HUVEC和原代HUVEC在许多研究领域具有相似性。在基因编辑方面,使用永生化的HUVEC可以避免一些原代细胞模型存在的问题,如CRISPR Cas9基因编辑效率低下、目的基因不稳定表达、有限代次内进行研究等。使用永生化HUVEC细胞系不仅可以提高实验的效率和可重复性,还能提供更稳定、持久且可控的细胞模型。现在,源井生物已成功构建永生化HUVEC细胞系,并且经过基因编辑认证,确保其编辑质量!如果您有该细胞系的基因编辑需求,快来找小源咨询吧!


参考文献

[1] Jaffe, Eric A., et al. "Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria." The Journal of clinical investigation 52.11 (1973): 2745-2756.

[2] Brandt, Camilla Blunk, et al. "HIF1A Knockout by Biallelic and selection-free CRISPR gene editing in human primary endothelial cells with ribonucleoprotein complexes." Biomolecules 13.1 (2022): 23.

[3] Medina-Leyte, Diana J., et al. "Use of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as a model to study cardiovascular disease: A review." Applied Sciences 10.3 (2020): 938.

[4] Liao, Danying, et al. "CRISPR-mediated deletion of the PECAM-1 cytoplasmic domain increases receptor lateral mobility and strengthens endothelial cell junctional integrity." Life sciences 193 (2018): 186-193.

[5] Schwefel, Konrad, et al. "Fibronectin rescues aberrant phenotype of endothelial cells lacking either CCM1, CCM2 or CCM3." The FASEB Journal 34.7 (2020): 9018-9033.

[6] Ogrodzinski, Lydia, et al. "Probing expression of E-selectin using CRISPR-Cas9-mediated tagging with HiBiT in human endothelial cells." Iscience 26.7 (2023).

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根据不同细胞特点选择适宜的转染方法(病毒法,化学转染法或电转法)将gRNA序列和Cas9蛋白转入细胞中,并根据不同的转染方法进行不同时长的药筛。药筛完成后进行单克隆筛选,通过靶位点扩增及测序验证筛选出成功敲除的阳性克隆,最终交付纯合子细胞株与相关数据报告。
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