干货丨HuH-7细胞培养和基因编辑Tips

HuH7 细胞系源自人类肝癌组织，由日本学者于 1982 年从一名 57 岁男性患者的肝肿瘤组织中分离建立得到。该细胞系因保留了白蛋白合成等部分肝细胞核心功能特性，且体外培养操作简便，已被广泛应用于肝病发病机制研究、HCV/HBV 等病毒复制机制探索、药物筛选及肿瘤生物学研究等领域，是肝脏相关基础研究与应用研究中不可或缺的经典细胞模型。小源今天就奉上独家细胞培养秘籍，带你深入解锁 HuH-7 细胞的培养技巧与基因编辑实操～

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细胞名称：人肝癌细胞（HuH-7）

细胞形态：上皮样细胞，贴壁生长

细胞培养条件：90%DMEM+10%FBS

气相：空气，95%；二氧化碳，5%

温度：37℃

换液频次：2-3天/次

传代比例：1:2-1:3

细胞生长状态参考：

●正常状态：细胞通常呈上皮多边样，大部分细胞呈不规则的多边形，但也会存在一些拉长的、纺锤形的细胞。

HuH-7细胞正常状态

●异常状态：细胞收缩变圆，贴壁不牢；可能出现细长的、不健康的丝状伪足；细胞碎片增多或胞质内出现透明空泡。

HuH-7细胞异常状态

1. 准备培养基

取7mL完全培养基于离心管中备用。

2. 细胞解冻

将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴。

3. 细胞离心

将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液。

4. 重悬与接种

用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中。

5. 继续培养

将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况。

1. 传代条件

当细胞汇合度达到80-90%时可进行传代。传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次。

2. 胰酶消化

加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞。将培养瓶放入培养箱孵育 1-2分钟。显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动轻易脱落时，立即终止消化。

3. 终止消化

加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化。细胞悬液转移至15mL离心管中。

4. 细胞悬液离心

1100 rpm 室温离心 4 分钟。离心结束，弃去上清。加入完全培养基重悬细胞。

5. 细胞传代

按照1:2-1:3比例接种至新的培养瓶。传代第二天观察细胞状态。

1. 收集细胞

按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中。

2. 细胞悬液离心

1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清。

3. 重悬与冻存

用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中。标注好名称、代数、日期等信息。

4. 降温与储存

将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存。

细胞形态：HuH-7细胞具有多个触角/伪足，属于正常现象。

培养基保存：确保培养基储存于4°C避光，并在有效期内使用。

培养环境：确保细胞培养环境正常。

操作细节：操作前需预热培养基和胰酶至37℃，避免温度应激。

细胞传代操作：避免过度吹打而造成细胞膜的损伤；贴壁不均匀时可轻摇培养瓶使细胞分布均匀。

1. 细胞状态要求

● 确保细胞状态良好，使用处对数生长期即汇合度在70-80%的细胞。

● 细胞活率＞85%，可通过台盼蓝进行检测。

● 使用低代次细胞。

● 注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害。

● 实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团。

2. 转染试剂与预实验

● 转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性。

● 建议进行药筛预实验找到最佳药筛浓度，以便于转染后进行药筛。

3. 电转法

● 控制细胞量，电转后根据细胞量接种至合适的培养板里。

● 使用温和的胰酶，并用含血清的培养基彻底终止消化。

● 用PBS洗涤细胞1-2次，彻底去除残留血清，避免离子干扰电穿孔。

● 进行预实验对电转参数进行优化。

● 保证电转后细胞贴壁率≥70%。

● 控制实验时间，电转全程不宜过长。

4. 慢病毒法

● 进行预实验找到最合适的MOI。

● 感染病毒前细胞汇合度控制在30-40%之间，不可过高。

● 感染前添加助染剂Polybrene。

● 感染后24h进行换液。

● 感染使用的病毒液避免反复冻融。

● 若感染效率过低可进行复感染（需确保细胞对病毒耐受性良好）或尝试使用离心法感染。

5. 脂质体法

● 选择适合HuH-7细胞的脂质体转染试剂。

● 通过预实验重新优化DNA/试剂比例，确定最佳转染条件。

● 使用增强剂：有些试剂系统提供专门的增强剂，可以显著提高在某些难转染细胞中的效率。

● 转染前24h进行细胞铺板，转染前细胞汇合度控制在60-70%。

● 先稀释DNA于Opti-MEM，再加脂质体（反向混合会失效）。

● 室温静置15-20分钟（＜10分钟复合不充分，＞30分钟毒性增加）。

● 转染培养基中严禁添加抗生素，因阳离子脂质体可增加细胞通透性，导致抗生素进入细胞引发毒性。

● 复合物添加时应均匀、缓慢地滴加到培养基里，并轻摇混匀，避免直接冲击细胞，切忌剧烈吹打。

1. 细胞状态要求

● 使用对数生长期的细胞进行铺克隆，铺克隆前细胞汇合度建议控制在70%左右。

● 铺克隆时细胞活率≥80%。

2. 试剂与预实验

● 提前预温所有试剂（包括培养基、胰酶、PBS）。

● 建议使用温和消化试剂（如TrypLE Express）。

3. 铺板策略

● 进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低。

● 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀；外围96孔加入PBS防止蒸发。

4. 稀释方法

● 使用“极限稀释法”进行铺克隆。

● 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间。

慢病毒感染后的细胞图片

电转后细胞图

1. 细胞生长缓慢如何解决？

表现：细胞增殖速度远低于正常（正常 2-3 天传代一次）。

可能原因：

(1) 细胞传代次数过多：细胞老化，活力下降。

(2) 接种密度过低：细胞汇合度太低，难以形成良好的生长环境。

(3) 培养条件不佳：培养箱温度、CO₂浓度不准确或不稳定。

解决方法：

(1) 控制传代次数：避免细胞过度传代，在细胞处于对数生长期内进行传代。

(2) 调整接种密度：根据细胞生长特性，调整接种密度至适宜范围。

(3) 检查培养箱参数设置是否正确，确保温度、CO₂浓度、湿度等条件适宜。

2. 细胞成团生长、分布不均匀怎么办？

表现：细胞在传代后聚集成大小不一的团块；细胞在瓶底集中在中间或边缘。

可能原因：

(1)吹打不充分；

(2) 传代时未重悬均匀。

解决方法：

(1) 在不过度损伤的前提下，适当增加吹打次数，将大的细胞团吹散。

(2) 接种到新瓶后，采用“十字法”或“八字法”轻轻晃动培养瓶，使细胞均匀分布。

3. 细胞形态异常是怎么回事？如何解决？

表现：细胞皱缩、边缘不清晰；细胞变大、颗粒增多、空泡增多。

可能原因：

(1) 血清质量差或细胞老化；

(2) 营养不足或消化过度；

(3) 代谢废物积累（培养过久）。

解决方法：

(1) 使用优质胎牛血清；复苏早期冻存的代次低的细胞株。

(2) 更换新鲜培养基，调整胰酶消化时间（一般1-2分钟）。

(3) 及时传代和换液，不要在细胞长满100%后才处理，在80%-90%密度时传代最佳。

小源提示：HuH-7细胞镜下观察到触角/伪足，属于正常现象，而细长的、不健康的丝状伪足是不正常的现象，要注意区分噢。

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