文库干货 | 基于流式分选的CRISPR高通量筛选避坑指南

引言

CRISPR文库筛选突破传统单基因研究局限，可无偏向性筛选调控细胞表型的关键基因，是挖掘功能基因与药物靶点的核心手段。针对表面分子、报告基因表达等可荧光示踪的性状，流式分选能够精准分离不同表型细胞，基于流式分选的CRISPR筛选可通过分组测序解析 sgRNA 富集规律，大幅提升功能性靶点的筛选效率，适用于免疫、肿瘤靶点发掘领域。

一、基于流式分选的CRISPR筛选应用场景

在CRISPR文库筛选中，流式分选不是万能的，但它在一类场景里几乎无可替代： 只要你能把一个生物学问题，转化成荧光信号的强弱，就能用流式分选来挖靶点。常见能筛的靶点类型主要有这几大类：

1. 信号通路活性 / 转录因子活性调控靶点

利用报告基因系统（如特定响应元件驱动GFP）或免疫染色，把通路活性变成荧光信号的强弱。比如筛NF-κB、Wnt、p53、HIF-1α等通路的新型调控因子，分选GFP高表达或低表达细胞群，或结合免疫染色筛选高/低信号的细胞，就能找到正/负调控该通路的基因。

Huang M,et al.Mol Cell. 2023[1]。该研究建立并验证了基于流式分选的CRISPR筛选实验体系，可应用于鉴定DNA损伤应答等多种信号通路的调控因子。

2. 细胞表面标志物调控靶点

利用流式细胞术筛选靶点是肿瘤免疫领域最常用的方式。比如想找调控PD-L1、MHC-I、CD47等免疫检查点或抗原呈递分子的基因，可以直接用荧光标记抗体染色，再分选表面蛋白高/低表达的细胞群，最后对细胞群进行NGS测序分析即可找到调控的基因。这类筛选不需要改造报告基因，直接在野生型细胞文库里就能做，非常贴近生理状态。

Rahimov F,et al.Nat Commun. 2025[2]。该研究利用基于流式分选的CRISPR筛选实验体系，在人源单核细胞系中系统性鉴定出295个IL-1β调控基因。

3. 细胞分化 / 转分化 / 干性调控靶点

利用谱系特异性表面标志物（如干细胞的CD133、分化细胞的特定Marker）或报告干细胞系，分选分化标志阳性/阴性群体，就能找出驱动或阻断某个分化进程的基因。

Teske M,et al.Nat Commun. 2025[3]。研究利用流式细胞术，基于CRISPR全基因组筛选鉴定出调控小鼠血内皮细胞命运的核心转录因子。

4. 代谢物感应 / 酶活性靶点

一些荧光探针可以直接读出细胞内的代谢状态，比如ROS水平、脂质含量、溶酶体pH等，可利用这些荧光探针分选信号偏移的细胞群，从而筛选相应的调控基因。还有可以利用基于荧光底物的系统，筛选蛋白酶、激酶活性的调节因子。

5. 病毒感染 / 细菌入侵相关宿主因子

利用荧光标记的病原体或报告病毒，分选感染阳性或阴性的细胞，可以找到宿主入侵或限制因子。

二、流式分选在文库筛选中的基本步骤

• 单细胞悬液制备：酶消化或机械吹打后收集细胞悬液，用筛网过滤，保证细胞分散，全程无菌操作。
• 染色标记：根据筛选目的，加上死活染料、表面抗体，或直接检测报告基因荧光。
• 上机分选：在流式分选仪上圈定目标群体（比如GFP-high的前10%），经流式仪分选入含培养基的收集管。
• 回收培养或直接抽提DNA：分选得到的细胞，一部分继续培养做后续验证，剩余全部细胞离心后提基因组DNA，进行sgRNA的深度测序。

三、流式分选需注意的事项

1. 流式分选天然更容易产生更多的假阳性结果

相比药物筛选而言，流式分选，本质上只对靶细胞进行了一轮物理富集，许多细胞可能只是因为处于特定的细胞周期、代谢波动，或者只是随机高表达了部分报告基因，就暂时进入了设定的阳性门。这些“暂时性”的假阳性细胞，在流式分选中会被一次性全部收进来，没有后续的自然淘汰机会。因此，流式分选得到的“阳性名单”，假阳性概率天然比多轮药筛高。

【小源Tips】 可以进行多轮富集，将收取到的细胞进行培养后再度分选，以此获得更纯的阳性细胞。另外，通过增加重复组别，也能在一定程度上排除假阳性结果的干扰。

2. 确保分选所需细胞量足够

流式分选出的细胞量过少会导致覆盖度严重不足，大量sgRNA无法被检测到，同时分选过程中由于随机误差被收集的”假阳性细胞“对实验结果干扰较大。

【小源Tips】 流式分选通常分选出荧光占比前后5-10%的细胞群，为了保证分选出的细胞有足够的覆盖度，在分选前通常需要准备1*10^7以上细胞量用于分选（对于全基因组文库则需要更多）。

3. 提防细胞聚团对实验结果造成的干扰

文库筛选的细胞往往经历了慢病毒包装、感染、抗性筛选等多步操作，细胞膜表面黏性上升；同时分选细胞量大、浓度高，很容易形成细胞团块。一旦形成微小的细胞团块，流式分选仪会将其识别为一个事件，造成数据偏差，或者在分选中损失大量细胞，甚至直接堵塞喷嘴，严重影响实验进程。

【小源Tips】 将细胞分成多份进行摇床染色，避免细胞量过多导致部分细胞无法被染色的情况，同时可以加入1-2mM的EDTA和25–50 U/mL DNase I以减少细胞聚团的现象。在分选前还需要用40 μm 筛网过滤，以避免分选过程中堵塞喷嘴。

4. 抗体染色不均匀，或者抗体特异性问题影响实验结果准确性

相比常规流式分析实验，流式分选所需的细胞量大，容易出现细胞染色不匀的现象，导致只有部分细胞被染色。另外，抗体特异性如果有问题可能会导致分选出的细胞群非实际所期望的目的细胞群，同样对实验结果产生巨大干扰。

【小源Tips】 在进行流式分选正式实验之前，需要先进行预实验，确保抗体有效性，还可以通过设置不表达目的蛋白的阴性对照组以及加入Fc封闭液以排除抗体的非特异性结果对实验结果造成的干扰。

5. 分选过程要减少对细胞的损伤

流式分选的过程时间长，并且对细胞损伤较大，需尽可能减轻分选过程中对细胞造成的损伤，否则导致分选出的细胞快速凋亡、DNA降解，严重影响后续基因组提取和NGS测序环节。

【小源Tips】 通过使用超高速流式分选系统（如贝克曼MoFloAstrios EQ ）以减少分选时长，同时在流式细胞收集管中加入适量的分选缓冲液，以降低分选过程中的物理冲击对细胞造成的损伤。

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参考文献

• Huang M, Yao F, Nie L, et al. FACS-based genome-wide CRISPR screens define key regulators of DNA damage signaling pathways. Mol Cell. 2023 Aug 3;83(15):2810-2828.e6. doi: 10.1016/j.molcel.2023.07.004. PMID: 37541219; PMCID: PMC10421629.
• Rahimov F, Ghosh S, Petiwala S, et al. A genome-wide CRISPR screen identifies the TNRC18 gene locus as a regulator of inflammatory signaling. Nat Commun. 2025 Nov 24;16(1):10346. doi: 10.1038/s41467-025-65277-y. PMID: 41285767; PMCID: PMC12644769.
• Teske M, Wertheimer T, Butz S, et al. Targeted CRISPR-Cas9 screening identifies core transcription factors controlling murine haemato-endothelial fate commitment. Nat Commun. 2025 Dec 13;16(1):11412. doi: 10.1038/s41467-025-66230-9. PMID: 41390669; PMCID: PMC12738756.