用CRISPR文库对AGS全基因组进行药物靶点高通量筛选，确认METTL1为潜在胃癌治疗靶点

使用CRISPR文库对AGS细胞系进行全基因组筛选并评估结果可靠性

CRISPR文库帮助探索必需基因的功能

使用CRISPR文库从必需基因中筛选出潜在胃癌药物靶点

敲除AGS细胞中的METTL1以验证CRISPR文库筛选策略的有效性

探究METTL1在GC细胞系中的作用及作用机制

教科书式CRISPR文库药物靶点筛选案例——AGS细胞系必需基因新发现！

前段时间，小源为大家整理了一份CRISPR文库的新手攻略，里面提到了CRISPR文库的应用（可点击回顾>>CRISPR文库火“出圈”啦！还不会用？这篇给你从头到尾梳理一遍！），今天就给大家分享一个CRISPR文库用于药物靶点筛选的案例，希望能帮助大家更好地了解如何使用CRISPR文库！

 胃癌是全球第五大常见癌症类型，也是死亡率第三高的肿瘤类疾病。虽然目前胃癌的早期诊断、手术、化疗及放疗等系统性治疗研究已取得巨大进展，但目前胃癌治愈存活率仍很低，近5年生存率仅在30%左右。因此寻找新的药物靶点、研发疗效更好的靶向药物迫在眉睫。

Zeng等人CRISPR敲除文库对胃癌细胞（Gastric Cancer Cell，GCC）的全基因组进行筛选，发现了184个新确立的必需基因、确定了41个必需基因为潜在药物靶点，进一步研究后证实METTL1为胃癌的潜在治疗靶点。具体研究思路如下：

使用CRISPR文库对AGS细胞系进行全基因组筛选并评估结果可靠性

    通过对Achilles、Sanger两个数据库中的GC样本进行相关系数比较分析，研究人员得到7个重叠的GC细胞系（见图S1），并发现必需关键基因定义一旦变更，这7个重叠GC细胞系的关键必需基因数据库间相关性将反转：Achilles定义的1969个关键必需基因在这两个数据库间表现出较强相关性，而Sanger定义的525个关键必需基因在这两个数据库间的相关性较弱或不相关（见图S1C和图S2C）。

图S1

图S2

因此，研究人员决定使用CRISPR文库来为确定GC细胞的关键基因及治疗靶点提供证据支持。他们采用三质粒体系通过脂质体法将TKOv3文库转染进293T细胞中进行病毒包装。接着使用病毒感染AGS细胞，通过嘌呤霉素筛选出转染成功的AGS细胞系。提取第0天、第10天以及第20天的对照组细胞（未施加压力的）的DNA进行深度测序对比后，他们发现基因缺失的数量随代数的增加而增加（见图1C），结合Wilcoxon秩和检验结果确认该筛选已顺利完成。

接着，研究人员应用MAGeCKFlute算法及RRA评分确认了854个AGS细胞系的必需基因，并为这些基因建立了一个新的数据库。经Pearson相关系数分析发现，这个新数据库的基因与Achilles、Sanger数据库的必需基因相关性很高，且通过对比TKOv3文库Moffat的关键必需基因和非必需基因列表对RRA评分排序的基因进行评估的曲线下面积为0.993（图1I），这些结果都表明CRISPR文库筛选的结果可靠性很高。

图1. 使用CRISPR文库对AGS全基因组进行负性筛选

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探索必需基因的功能

而后，通过对筛选结果进行分析，他们发现第10天和第20天的筛选出的必需基因中有689个是相同的。接着他们使用GO生物学功能富集分析对每个时间点的所有必需基因的功能进行研究，找出了最密切相关的10个功能（图2B），并发现第10天分析结果仅能说明必需基因与维持核糖体和RNA正常功能密切相关，而第20天的分析结果则能具体到血红素合成过程、细胞药物响应等功能（图2E）。这说明CRISPR文库筛选结果是可靠的，且延长筛选时间可以摸清必需基因的具体功能。

图2. 不同时间点TKOv3文库筛选出的必需基因

研究人员对筛选结果中的9个必需基因和1个非必需基因进行分析，发现只有SNRPB和TOP3A的sgRNA作用不尽一致，其他7个基因的sgRNA都对细胞活性表现出一致作用（图3A）。在AGS细胞中建立这10个基因的敲低细胞模型以研究这些基因对细胞活性的影响（图3B）。ALamar Blue检测结果显示，敲低非必需基因RNASET2不会影响细胞活性及细胞集落数量，而敲低必需基因细胞活性会下降、细胞集落数量会减少（图3D、E），这也验证了筛选出的基因确实为AGS细胞存活所必需。

在这9个必需基因中，CIT和TACC3先前并未被Achilles和Sanger数据库纳为必需基因，但它们确实与维持细胞活性密切相关。这样的基因TKOv3文库筛选结果中还有182个。因此，这184个新发现的必需基因填补了Achilles、Sanger数据库的某些空白。不仅如此，研究人员还发现与TCGA数据库中正常胃粘膜组织相比，胃腺癌（GAC）组织中的这9个基因表达均上调（图3G），提示文库筛选出的必需基因或为癌症治疗潜在药物靶点。

图3. 评估9个必需基因

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从必需基因中筛选出潜在药物靶点

为了筛选出具有特异性的潜在药物靶点，研究人员首先去除了关键必需基因，仅保留AGS细胞系的特异性必需基因。接着使用PMA MAS 5.0剔除AGS细胞系中TCGA-STAD显示低表达的基因，比较剩余的TCGA-STAD差异表达基因，确认了GAC组织中上调的41个必需基因为潜在药物靶点（图4A），其中包括上述提及的CIT、TACC3、MTBP。

图4. 潜在药物靶点筛选

敲除AGS细胞中的METTL1以验证筛选策略有效性

与CIT、TACC3一样，tRNA N⁷-m⁷G甲基转移酶（METTL1）基因并未被Achilles、Sanger收录为必需基因，却在CRISPR文库筛选中被认定为必需基因的基因。为进一步验证METTL1对GC细胞系生物学功能的影响，研究人员设计了三种针对METTL1的siRNA，建立了METTL1 AGS敲低细胞系。METTL1-siRNA2和METTL1-siRNA3的敲低分别导致细胞存活率下降22.46%、数量下降27.09%（图4D），CCK8实验结果表明细胞活力以siRNA剂量和时间依赖的方式下降（图4E、F），集落形成分析实验中也发现敲低METTL1会导致细胞集落数量锐减77.82%（图4G）。这些都说明METTL1基因对AGS细胞的存活而言至关重要，是AGS细胞的必需基因，该结论与之前的实验结果一致，从正面证明了CRISPR文库筛选策略的有效性。

而后，研究人员使用同样的方法对METTL1在其他GAC细胞系中的作用进行了研究，发现METTL1可能对多个GAC细胞系的增殖都有影响（图4K）。

进行METTL1体内敲低实验验证METTL1是否是潜在药物靶点

将转染了METTL1-siRNA或NC-siRNA的MKN45细胞通过皮下注射至BALB/c裸鼠体内，形成皮下肿瘤。在第20天对肿瘤的体积、重量进行测量，发现METTL1敲低组的肿瘤平均体积和重量较对照组肿瘤的分别低55.19%和55.97%。说明敲低METTL1可以有效抑制肿瘤的生长，METTL1可为胃癌治疗的药物靶点。

图5. METTL1敲低可抑制体内肿瘤增长

探究METTL1在GC细胞系中的作用及作用机制

对METTL1敲低的GC细胞的细胞周期进行研究发现，敲低METTL1后细胞周期标志物CDK1的水平也显著下降。进一步研究发现，敲低METTL1将显著下调AKT和STAT3水平（图6），提示METTL1可能通过激活AKT/STAT3/CDK1信号通路在细胞周期中发挥作用。

图6. AGS细胞系中METTL1作用分析

   最后，研究人员还对GEO、TCGA数据库中的临床样品数据进行分析，发现与正常胃粘膜组织相比，GAC组织中的METTL1 mRNA确实是过表达的，且随着肿瘤分期的递增，METTL1 mRNA的表达逐渐增加，这表明METTL1可能是一个有效的抗肿瘤药物靶点。

   该研究发现了184个新确立的AGS细胞系必需基因、确定了41个潜在药物靶点，验证了METTL1在肿瘤细胞发展中的作用，呈现了一个完整的CRISPR文库筛选思路：从用CRISPR gRNA文库感染细胞、细胞筛选、DNA测序到基因功能验证！

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