技术前沿|编辑效率最高提升 16.2 倍！AcrIIA27 靶向 sgRNA 机制突破 CRISPR 编辑瓶颈

引言

CRISPR-Cas 系统是原核生物的适应性免疫系统，噬菌体进化出抗 CRISPR（Acr）蛋白实现对其的抑制。目前已发现多种 Acr 蛋白通过不同机制抑制 CRISPR-Cas 活性，但靶向 sgRNA 的抑制机制尚未被深入揭示。哈尔滨工业大学黄志伟团队在Nature Structural & Molecular Biology发表最新研究成果，研究通过冷冻电镜解析AcrIIA27与 SpyCas9-sgRNA 复合物的结构，阐明 AcrIIA27 靶向 sgRNA 抑制 Cas9 的分子机制，并基于该机制 提出 PTP RNA 截短策略，显著提升 CRISPR-Cas9 及 TnpB 系统的基因编辑效率与特异性。

研究背景

CRISPR-Cas 系统广泛存在于细菌和古菌中，通过识别并切割入侵的核酸发挥免疫功能。噬菌体为对抗该系统，进化出多种 Acr 蛋白。已报道的 Acr 蛋白抑制机制主要包括干扰 CRISPR-Cas 复合物组装、阻止靶标核酸结合、抑制核酸切割活性等。目前发现的广谱性 Acr 蛋白多靶向 Cas 蛋白的保守结构域，但靶向 sgRNA 实现广谱抑制的 Acr 蛋白尚未被报道。同时，CRISPR-Cas9 及新型编辑器（如 TnpB）存在编辑效率不足、脱靶效应等问题，限制了其应用。探索 Acr 蛋白的抑制机制，有望为优化基因编辑工具提供全新策略。

研究目的

本研究通过解析 AcrIIA27 与 SpyCas9-sgRNA 复合物的冷冻电镜结构，揭示 AcrIIA27 靶向 sgRNA 抑制 Cas9 活性的分子机制，并基于该机制开发提升 CRISPR-Cas 及 TnpB 系统编辑效率的通用策略。

研究路线

• 结构解析： 纯化 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA27 复合物，通过冷冻电镜解析其三维结构，确定 AcrIIA27 与 sgRNA 的结合位点。
• 机制验证： 通过点突变、BLI、体外切割实验，验证 AcrIIA27 关键氨基酸残基在结合 sgRNA 及抑制 Cas9 活性中的作用；通过结构比对，阐明其造成空间位阻阻止底物 DNA 结合的机制。
• 广谱性检测： 选取 II-A、II-B、II-C 型 Cas9 同源蛋白，检测 AcrIIA27 对其的抑制活性，明确其广谱抑制特性。
• 编辑工具优化： 基于 AcrIIA27 结合的 sgRNA 区域（PTP RNA），设计截短型 sgRNA/reRNA，在 HEK293F 细胞中验证其对 Cas9 及 TnpB 编辑效率和特异性的提升作用。
• 机制阐释： 结合细胞实验与结构分析，提出 PTP RNA 截短通过消除非特异性蛋白结合、减少空间位阻提升编辑效率的机制。

PTP RNA截短策略在多种编辑系统中的应用

主要结果

1.SpyCas9-sgRNA-AcrIIA27 三元复合物结构特征

冷冻电镜结构显示，SpyCas9 呈典型的双叶结构（识别叶 REC 和核酸酶叶 NUC），AcrIIA27 以 1:1 的化学计量比结合在 SpyCas9-sgRNA 复合物上，主要与 sgRNA 的重复 - 反重复双链区域（G21-U45）相互作用，同时与 SpyCas9 的 REC1 和 WED 结构域有少量接触。AcrIIA27 具有独特的折叠方式，包含 3 条 β- 折叠、2 个 α- 螺旋和 3 个环结构（loop1-3），其表面带正电区域嵌入 sgRNA 的沟区，通过静电相互作用和氢键稳定结合。

图1.SpyCas9–sgRNA–AcrIIA27三元复合物的冷冻电镜结构

2.AcrIIA27 通过 loops 区域特异性结合 sgRNA

Loop1 的带正电残基（H17、R67、R71、R72）与 sgRNA 的 U24、A26 等核苷酸的磷酸骨架形成静电相互作用；Loop2 的 S48、K50、W51 等残基与 U37、A38 的磷酸骨架形成氢键。BLI 实验证实，野生型 AcrIIA27 与 SpyCas9 的 sgRNA 结合亲和力极强（KD < 1 pM），而 Loop1 和 Loop2 关键残基突变后（如 R66A、R67A），结合亲和力下降超过 10 倍。体外切割实验显示，关键残基突变的 AcrIIA27 对 SpyCas9 的抑制活性显著降低甚至完全丧失；噬菌体噬斑实验进一步验证，这些突变体无法恢复 T5 噬菌体的存活能力。

图2.AcrIIA27对sgRNA的识别

3.AcrIIA27 对多种 Cas9 同源蛋白具有广谱抑制活性

系统发育树分析显示，选取的 Cas9 同源蛋白覆盖 II-A（SpyCas9、SauCas9、FrCas9）、II-B（FnCas9）、II-C（Nme1Cas9、Nme2Cas9、GeoCas9）型。体外 DNA 切割实验表明，AcrIIA27 能够有效抑制 II-A 和 II-C 型 Cas9 的活性，对 SpyCas9 的抑制效果优于 AcrIIA4 等特异性抑制剂；但对 II-B 型 FnCas9 无抑制作用。BLI 实验证实，AcrIIA27 与 SauCas9、Nme1Cas9 的 sgRNA 均具有较高结合亲和力，关键残基突变会显著削弱其抑制活性，表明其广谱抑制依赖于与 sgRNA 的结合。

图3.AcrIIA27可抑制II-A型和II-C型Cas9的同源蛋白

4.AcrIIA27 通过空间位阻阻止底物 DNA 结合 Cas9

结构比对发现，AcrIIA27 的 N54-T59 区域与底物 DNA 的 PAM 邻近序列空间位置重叠。体外切割实验显示， 截短 N54-T59 的 AcrIIA27 完全丧失对 SpyCas9 的抑制活性，但其与 sgRNA 的结合亲和力未受影响；截短 sgRNA 上 AcrIIA27 结合的茎环区域（G29-C40）后，AcrIIA27 的抑制作用显著减弱，而 SpyCas9 的切割活性不受影响， 证实 AcrIIA27 通过空间位阻抑制底物 DNA 结合。

图4.AcrIIA27对SpyCas9的抑制机制

5.PTP RNA 截短策略显著提升基因编辑效率与特异性

针对 SauCas9 的 sgRNA，截短其 PAM 邻近的 PTP RNA 区域（U35-A60）后，在 HEK293F 细胞的多个内源基因位点（如 EMX1、GRIN2B）的编辑效率提升 1.2-2.1 倍。 针对 IS607 TnpB 系统的 reRNA，截短其 TAM 邻近的 PTP RNA 区域（茎环 3 的 MS1 位点）后，在 EMX1、DNMT1 等位点的编辑效率提升 1.5-6.1 倍。脱靶效应分析显示，截短型 PTP RNA 在提升编辑效率的同时，降低了脱靶位点的编辑水平，且编辑效率提升与 reRNA 表达水平无关。 该策略在 ISRin、ISAre 等 TnpB 同源蛋白中同样有效，部分位点编辑效率提升超过 16 倍。

图5.PAM近端RNA截短可提高基因组编辑效率

图6.TAM近端RNA截短可提高基因组编辑效率

研究意义与创新点

• 理论意义 首次发现并阐明 AcrIIA27 靶向 sgRNA 的磷酸骨架抑制 Cas9 活性的分子机制，拓展了 Acr 蛋白的抑制模式分类，为筛选新型 Acr 蛋白提供了新方向（如聚焦 RNA 结合蛋白家族）。揭示了 sgRNA 的溶剂暴露区域（PTP RNA）易与细胞内带正电蛋白发生非特异性结合，从而影响编辑效率的现象，为理解 CRISPR 系统的细胞内调控机制提供了新视角。

• 应用价值 提出的 PTP RNA 截短策略具有通用性，可显著提升 CRISPR-Cas9 及 TnpB 等紧凑型编辑器的基因编辑效率与特异性，且无需改造 Cas 蛋白，简化了编辑工具的优化流程。截短后的 sgRNA/reRNA 长度缩短，有助于提升腺相关病毒（AAV）等载体的递送效率，推动基因编辑技术在体内治疗中的应用。

• 技术创新 突破了 Acr 蛋白靶向 Cas 蛋白的传统认知，首次报道靶向 sgRNA 实现广谱抑制的 Acr 蛋白，为开发可调控的基因编辑工具提供了新靶点。从 Acr 蛋白的抑制机制反向推导，提出编辑工具优化策略，实现了基础研究向应用技术的快速转化。

文章小结

本研究通过冷冻电镜结构解析和生化功能验证，阐明了 AcrIIA27 靶向 sgRNA 的 PTP RNA 区域，通过空间位阻抑制 Cas9 活性的分子机制。 基于该机制设计的 PTP RNA 截短策略，能够有效消除非特异性蛋白结合带来的空间位阻，显著提升 CRISPR-Cas9 及 TnpB 系统在人细胞中的基因编辑效率与特异性。 该研究不仅丰富了抗 CRISPR 蛋白的作用机制，更为开发高效、精准的基因编辑工具提供了全新的优化思路，具有重要的理论意义和应用价值。

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参考文献

Yu L, Yin M, Zhu Y, Lu Z, Xiao B, Zhou F, Yu Y, Huang Z. An anti-CRISPR targets the sgRNA to block Cas9 and guides the design of enhanced genome editors. Nat Struct Mol Biol. 2026 Jan 19. doi: 10.1038/s41594-025-01741-z. Epub ahead of print. PMID: 41555077.