干货系列丨THP-1细胞培养小课堂

干货丨THP-1细胞培养小课堂

上期小源老师给大家推出了RAW264.7细胞培养干货，受到了大家的一致好评，小源非常感谢各位的鼓励！现在推出第2期细胞培养干货-THP1，带好小本本和笔，一起来上课吧~

THP-1是从急性单核细胞白血病患者的外周血中分离出的单核细胞。在某些诱导分化剂作用下，THP-1细胞可以被诱导分化为多种巨噬细胞，是研究炎症、免疫反应等领域的理想模型。此外，还可使用CRISPR Cas9技术编辑的THP-1细胞进行巨噬细胞作用机制、免疫应答通路研究、炎症疾病治疗开发等研究。

值得注意的是，THP-1是悬浮细胞且喜欢酸性环境，它的补液、传代方法与贴壁细胞大有不同，究竟有什么不一样呢？跟着小源来了解一下吧！

首先，了解一下THP-1的基本信息。

图1 THP-1细胞生长正常图片

细胞复苏：

1) 准备工作：将完全培养液置37℃水浴锅预热30分钟。

2) 在超净台内吸取7 mL完全培养液至15 mL离心管中

3) 将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化；

4) 将细胞悬液转至提前准备好的完全培养液中，盖上盖子，离心1100 rpm室温4分钟；

5) 于超净台内吸弃上清，吸取1 mL完全培养液重悬细胞至单细胞状态，转移至装有4 mL完全培养液的T25 cm²培养瓶(或者6 cm的皿)中，写上细胞名称、复苏日期、代次，放置37℃、5% CO₂培养箱中培养；

6) 第二天观察细胞状态。

换液：

半换液：细胞状态良好，细胞碎片少，培养基没有变黄的情况

1）将培养瓶竖立静置10-15 min，使细胞自然沉降。

2）小心吸一半培养基弃掉（若细胞密度较低，可将吸取的一半培养基转移至离心管后1100 rpm离心4 min，然后用新鲜培养基重悬后放回原瓶培养）。

3）原瓶补充一半的新鲜完全培养基。

离心换液：细胞状态良好，细胞碎片较多，培养基变黄的情况

1）将所有细胞悬液转移至离心管中。

2）1100 rpm离心4 min。

3）离心结束，弃去上清，加入1 ml PBS重悬后转移至1.5ml EP管中再次离心（此步骤目的是去除细胞碎片，若细胞碎片较多，可用PBS重复清洗2次，若无可省略此步骤）

4）培养瓶中加入适量完全培养基

5）离心结束后用完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种回培养瓶，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

注意事项：

THP-1细胞更喜欢酸性环境，在偏酸性环境中，THP-1生长得更好，所以当培养基稍微变黄（呈橘红色）时，是适合细胞生长的，此时补液或半换液即可，避免频繁离心换液。

细胞传代：

离心法：

1）将所有细胞悬液转移至离心管中，1100 rpm离心4 min

2）离心结束弃上清，用适量完全培养基轻柔混匀细胞，吸取20 ul细胞悬液进行细胞计数

3）根据计数结果确定传代比例，将细胞密度调整为2×10⁵~4×10⁵个细胞/mL，视细胞培养体积将细胞培养在不同规格的培养瓶中。

4）置于37℃、5%CO₂培养箱内培养。

直接分瓶法：

1）用电动移液枪轻柔混匀培养瓶里的细胞

2）吸取20 ul细胞悬液进行细胞计数

3）根据计数结果将细胞密度调整为2×10⁵~4×10⁵个细胞/mL，用移液器吸取培养瓶内细胞悬液，均分到若干个新培养瓶中，每瓶再补充适量的新鲜完全培养基

4）置于37℃、5%CO₂培养箱内培养。

细胞冻存：

1）将培养瓶里的细胞悬液全部转移至离心管中

2）1100 rpm离心4 min，弃上清，加入适量4℃预冷的冻存液重悬细胞，吸取20 ul细胞悬液进行细胞计数，并调整细胞密度至少为2×10⁶~5×10⁶个细胞/mL

3）按1 mL/管分装至冻存管中，将冻存管放置于冻存盒中然后转移至-80℃冰箱

4）过夜后，将冻存细胞转移至液氮罐内保存。

注意事项：

1.THP-1细胞对冻存温度比较敏感，建议冻存后立即转入-80℃冰箱，长期保存需放置液氮中。

2.冻存时细胞活率建议大于90%，每管冻存细胞数至少在2×10⁶~5×10⁶个细胞/ml。

常见问题及解决方法

1. 培养过程中细胞碎片过多或者药筛后死细胞过多：

图2 细胞碎片多且死细胞多

圆形透亮、饱满、不皱缩的细胞是活细胞。若细胞碎片或者死细胞过多，可在细胞进行离心后根据细胞量加入适量PBS重悬，重悬后将细胞悬液转移至1.5ml EP管中低速离心（800 rpm离心3 min），离心结束尽可能地吸干净PBS，可重复两次此步骤，根据离心下来的细胞量接种至合适的培养皿中（接种到小的皿中更好培养，先不要接种到大的皿）

2.培养过程中细胞聚团:

少量细胞聚团属于正常现象，若聚团过多，可考虑以下处理方法：

1) THP-1细胞对血清质量有一定要求，可更换更好的血清品牌或者提高血清浓度（不超过20%，血清含量过高也会对细胞有毒性）

2) 控制好细胞密度，不要太稀或者过密

3.冻存复苏活率低（存活率低）：

1) 因为thp-1是悬浮细胞，易受到冻存的影响，所以需要在冻存时加大细胞密度以提高复苏细胞的存活率，建议冻存时细胞密度至少在2×10⁶~5×10⁶个细胞/mL。

2) 复苏时，若对冻存细胞数量不确定，可将细胞复苏至6孔板的单孔中，待细胞状态恢复后再转移至更大体积的培养瓶中继续培养。

基因编辑小tips

小源拥有N多例THP-1细胞基因编辑经验，一并分享给你~

1.如何提高单克隆形成率？

1) 铺克隆时细胞活率需要＞90%

2) 稀释细胞计数后结果最好介于1×10⁶-2×10⁶之间

3) 建议使用优级胎牛血清

4) 铺克隆时建议用PBS清洗两次

2.细胞转染时需要注意什么？

1) 细胞活率＞90%，细胞状态正常，肉眼看都是圆形透亮、细胞膜完整的细胞

2) 病毒感染法进行正式实验前建议进行预实验找到最适MOI及最佳药筛浓度；确保感染的病毒滴度达标；感染前添加助染剂Polybrene；感染时建议在24孔板或者12孔板内进行

又是干货满满的一天！THP-1细胞质量是实验成功的关键之一，源井的THP-1细胞系经过上百例基因编辑实验优选，源井还可提供基因编辑技术服务，想要轻松获得优质的THP-1细胞可以联系小源，现在野生型细胞买1送1哦~