如何快速获得单克隆细胞

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发布日期:2020年08月06日
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如何快速获得单克隆细胞


随着CRISPR/Cas9基因编辑技术越来越普遍,细胞单克隆的形成显得越来越重要。然而,单克隆的成功形成在技术上具有挑战性,单克隆的生长时间长、获得单个阳性克隆的几率极低等问题确实让很多人头疼。单克隆形成率可能会受到多种因素影响,其中两个因素尤为重要,一个是细胞接种存活率,另一个是细胞的增殖活力。


1 如何提高细胞接种存活率

1)保持稳定的pH值

大多数细胞培养基是用CO2碳酸盐缓冲体系配制的,适用于二氧化碳培养箱的二氧化碳分压。但是当这些缓冲剂在正常大气条件下,二氧化碳将从培养基中蒸发,会导致培养基的pH升高到碱性范围(含酚红的培养基中,颜色会变得更紫),这会显著地影响细胞的生存力。因此,在使用细胞培养基时可使用HEPES缓冲体系的培养基,它不依赖于碳酸盐,是一种更好、更安全的选择。

2)保持合适的温度

使用预热至37摄氏度的培养基、胰酶及PBS,使细胞在相对稳定的条件下消化和极限稀释。

3)对于比较敏感的细胞,可相应提高细胞的接种量,例如从96孔板接种50个细胞提高到80个细胞。


2 如何提高细胞的增殖活力

1)适当传代

使用极限稀释法接种细胞后,培养至细胞形成微克隆(∼50‐100个细胞)。将每个孔中的微克隆转移至一个96孔板的新孔中。当新孔中细胞生长至80%的汇合度,将孔中细胞转移至一个48孔板的一孔中。使细胞继续增殖生长至获得足够数量的细胞用于验证分析。

2)添加合适的辅助因子

尽管血清中含有细胞生长所必须的营养物质,在细胞培养基中添加适量的添加剂可以促进细胞生长,例如胰岛素、transferrin和硒。对于某些细胞系,乙醇胺可能也很重要。在某些情况下,附着因子,如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、玻璃黏连蛋白和生长因子对细胞的生长也是有益的。


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