基因编辑技术的快速发展正在重塑生命科学研究的方式，而在众多工具中，CRISPR/Cas9 毫无疑问是近十年最具革命性的技术之一。相比基因敲除， 基因敲入（Knock-in） 更像是一场精密的“基因手术”——不仅要切得准，还要缝得好。通过将外源序列精准插入到基因组指定位置，研究者可以实现内源蛋白可视化、构建突变模型、建立药筛系统，或打造稳定表达外源基因的细胞模型，为基础研究、药物开发乃至基因治疗提供坚实模型。而基因敲入的背后，是细胞自身精巧的同源定向修复（HDR）机制。一次 DNA 双链断裂发生后，细胞会在两条修复路径之间做出选择：高效但粗糙的 NHEJ，或精密但效率较低的 HDR。我们所期待的正是后者，利用带有同源臂的 Donor 模板，细胞能够将指定序列“无缝接入”基因组，完成一次精准的编辑事件。下面，小源带你从原理到实操，从优化策略到源井的技术亮点，完整走一遍基因敲入的构建旅程。

一、CRISPR/Cas9：精准敲入的幕后逻辑

敲入的旅程，始于一条“聪明”的 sgRNA。它像一枚信使，引导 Cas9 找到基因组中独一无二的目标点，再由 Cas9 完成致命而精准的一刀。之后，Donor 模板便开始参与修复，负责“递交”新的序列片段。敲入能否成功取决于很多变量：细胞周期、sgRNA设计、同源臂构建、电转效率、供体形式甚至细胞状态。正因为步骤多、变量大，敲入实验往往让科研人员既期待又紧张。HDR 是敲入的关键，但它只在细胞周期的 S/G2 期高效运作。于是，科研人员们开始想办法让细胞“乖乖地在 S/G2 区间停留久一点”。因此， 源井生物的EZ-HRex™技术 就诞生了，该技术通过调控细胞周期并抑制NHEJ通路，让 HDR 处于“最佳工作状态”，大幅提升了同源重组效率，使转染后细胞群中HDR基因型比例达到84%。

在具体实施上，需要对目标位点设计合适的sgRNA，并构建携带插入片段及两端同源臂的供体模板。sgRNA的设计需确保靶位点附近存在PAM序列（如Cas9需识别NGG），同时避免与基因组其他区域高度同源以降低脱靶风险。供体模板通常为带有左右同源臂（一般500–1000 bp）和插入片段（如报告基因、标签序列或突变位点）的双链DNA；在某些方法（如Easi-CRISPR）中，也可采用长单链DNA供体以提高插入效率。此外，为提高编辑成功率，可联合使用Cas9蛋白- sgRNA复合体（RNP）或Cas9 mRNA传递等方式。

二、基因敲入细胞的完整实验路线图

为了让复杂流程更易理解，小源将整个实验拆为两个阶段： 预实验探索 与 正式敲入实验。

（一）预实验 ：四大摸索，决定项目成败的“前置伏笔”

1.药筛浓度摸索：找到刚好能“全灭”的剂量 : 使用载体对应的抗性药物跑一个梯度杀伤曲线，确定能在 2–3 天内杀死全部未转染细胞的最低浓度。这一点至关重要，因为药太轻，会出现假阳性的情况；药太重，真阳性也会死。以下的详细操作，可以供您参考：

• 1）将对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，接种至 12 孔板，培养液总体积为 1ml。细胞放入 37℃，5% CO2 培养箱中继续培养 24 小时。
• 2）当汇合度达到 50%左右时，将培养基换成含有不同浓度的 Puromycin 的药筛培养基，浓度梯度为：0，1，1.5，2，3，4μg/ml。（若 CRPSPR-U™ 表达质粒是携带其他抗性基因，则根据抗性基因选择对应的药物进行药筛。）
• 3）2-3 天后镜下观察细胞，选择细胞全致死的最低浓度作为后续实验的药物筛选浓度。

2.单克隆形成摸索：确认你的细胞“是否愿意单独生活”: 不同细胞系的“独居适应力”差异巨大：有的细胞一粒就能长成大片；有的则必须“抱团取暖”。通过 96 孔板稀释实验统计克隆形成率，可以为后续克隆化提供最佳策略。以下的详细操作，可以供您参考：

• 1）将对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，进行细胞计数。
• 2）取一定量的细胞悬液，稀释并接种至 96 孔板中，每孔培养液总体积为 100μl。细胞放入 37℃，5% CO2培养 箱中静置培养。
• 3）7-10 天后，镜下观察细胞是否有增殖趋势并且形成细胞簇，统计各组的单克隆数量。

3.转染方法摸索：找到细胞最能接受的那组“电击参数”: 将对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，设置几个不同的电转程序进行电转，转染 24h 后观察转染效率并拍 照保存。选择转染率和细胞活率都较好的电转参数作为正式实验的电转条件。

4.靶点测序：确保“剪刀”不会剪错地方: PCR 扩增靶点区域 → 测序 → 与理论比对，确认 sgRNA 设计的位点在目标基因上完全正确，是敲入前的必做检查。以下的详细操作，可以供您参考：

• 1）使用血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒提取细胞的基因组 DNA。
• 2）PCR 扩增打靶区域，PCR 反应体系如下：

  试剂名称	体积（μL）
  2 * Taq Master Mix	25
  引物 Forward（10μM）	1
  引物 Reverse（10μM）	1
  ddH2O	22
  Template	1
  Total	50

• 3）PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，若 PCR 产物的条带大小与理论一致，则将 PCR 产物测序。
• 4）将测序结果与理论序列比对，确认 gRNA 打靶位点序列的正确性。

（二）正式实验：从电转到阳性克隆筛选的完整流程

1.电转靶细胞：这是敲入实验的关键起点

• 1）将对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，取部分细胞检测其数量以及活率。
• 2）取 5×10 5~1×10 6个细胞于无菌管中，300×g离心3分钟。
• 3）弃上清，细胞沉淀用 100μl Buffer R 重悬，加入 5 μg 无内毒素的 CRPSPR-U™ 表达质粒5μg的 Donor 载体混合均匀。
• 4）电击杯中加入 3ml Buffer E2，随后放入电转仪的卡槽。
• 5）使用 100μl 电转枪头吸取细胞与上述混合物，插入电击杯中，设置电转条件，开始电击。
• 6）提示电转完成后，将细胞接种于准备好预热培养基的 6 孔板中继续培养。
• 7）重复上述步骤，直至所有样品电转完成。

2.Cell pool 筛选与单克隆化：Pool 结果更像是“开盲盒前的提示”，不能作为最终判断。

• 1）转染 24-72 小时后，镜下观察电转效果，加药物对细胞进行筛选。
• 2）取一定量的细胞悬液，使用有限稀释法稀释并接种至 96 孔板中，细胞放入 37℃，5% CO2 培养箱中静置培养。

• 3）剩余的细胞，使用 TIANGEN 血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，同时设计引物针对敲除区域进行 PCR 扩增。PCR 反应体系如下：

  试剂名称	体积（μL）
  2 * Taq Master Mix	25
  引物 Forward（10μM）	1
  引物 Reverse（10μM）	1
  ddH2O	22
  Template	1
  Total	50

  PCR 反应程序如下：

  STEP 1	95℃	3min	预变性
  STEP 2	95℃	15s	循环 30 次
  	60℃	15s
  	72℃	1kb/min
  STEP 3	72℃	5min
  	4℃	Forever

• 4）PCR 产物测序。一般在 gRNA 打靶位点附近的序列测序中，阳性样品会在靶点位置及之后的序列中出现套峰。但如果编辑效率较低时，可能套峰不明显，影响判断。Pool 的编辑效率可作为参考，但并不能完全反映实际的实验情况。
• 5）细胞接种至 96 孔板培养约一周后，观察克隆的生长情况，标记含有单克隆细胞簇的孔。
• 6）约两到四周后将长起来的单克隆消化下来，一分为二传至 2 块 96 孔中继续培养。
• 7）当细胞汇合度达到 60%以上时，即可取出一块板用于单克隆的鉴定。

3.单克隆筛选鉴定：找到真正的“基因敲入细胞”

• 1）将 96 孔板内的培养基倾倒干净，加入 100μl Ubigene 快速核酸释放试剂，室温静置 10 分钟。
• 2）3000rpm 离心 5 分钟，细胞的核酸即可释放到上清中。
• 3）PCR 扩增敲除区域，反应体系如下：

  试剂名称	体积（μL）
  2 * Taq Master Mix	25
  引物 Forward（10μM）	1
  引物 Reverse（10μM）	1
  ddH2O	22
  Template	1
  Total	50

  PCR 反应程序如下：

  STEP 1	95℃	3min	预变性
  STEP 2	95℃	15s	循环 30 次
  	60℃	15s
  	72℃	1kb/min
  STEP 3	72℃	5min
  	4℃	Forever

• 4）PCR 产物测序，从测序分析敲除结果：
  • 若测序结果无套峰且与野生型一致，则该克隆为未成功编辑的克隆；
  • 若测序结果无套峰且与敲入序列一致，则该克隆为成功敲入的克隆，每个等位基因突变情况一样；
  • 若测序结果有套峰，则该克隆可能为杂合子，或者等位基因 indel 情况不一样的编辑克隆。

4.阳性克隆扩增与冻存

对鉴定为成功敲入的阳性克隆，继续传代扩增。待细胞数量足够时，将其冻存备份。

三、六大影响因素：决定敲入效率的“秘密调节器”

基因敲入效率受多种因素影响，需要采取相应的优化措施：

1.HDR vs NHEJ 修复竞争： HDR在细胞周期的S/G2期发挥作用，而NHEJ在整个细胞周期中均可进行。因而常通过 细胞周期同步化 来提高HDR频率。例如使用药物将细胞阻滞在G2/M期，可将精确敲入效率提高3–6倍。与此同时，使用NHEJ抑制剂（如SCR7）亦可增强HDR占比。源井生物的CRISPR-U™平台实现了更高的基因切割效率与同源重组效率，基因编辑效率提升10-20倍。

2.sgRNA设计质量： 选择合适的靶点和高特异性的sgRNA非常关键。应优先选择有强PAM序列（NGG）且在基因组中唯一的20nt靶点，以避免脱靶。可借助在线工具对潜在脱靶位点进行风险评估。

3.供体模板设计： 同源臂长度和供体形式（双链DNA或长单链DNA）都会影响整合效率。一般建议同源臂长度在几百至一千碱基，以充分引导修复；若插入片段较小，单链供体（ssDNA）也可用于提高效率。在供体中嵌入可筛选标记（如荧光蛋白或抗性基因）可以帮助快速鉴定敲入事件。

4.转染效率： 优化转染条件（如电转参数或转染试剂配比）和细胞状态可显著影响结果。使用高质量、无内毒素的质粒或试剂，确保细胞活性，是提高敲入效率的基础。某些细胞系需要额外的生长因子或ROCK抑制剂来促进单细胞存活。

5.单克隆形成条件： 大多数细胞系单克隆成活率较低（传统限制性稀释法效率往往只有0–30%）。通过优化培养环境可提高单克隆形成率：例如在培养基中添加适量的外基质，使单细胞在更类似“集体”环境中生长，可以提高单克隆成活率。

6.高通量基因型鉴定： 对大批克隆进行基因型分析时，可使用高通量测序或多重PCR等方法。源井生物开发的“基因型鉴定小工具”能够快速解析转染后细胞池的测序图谱，1分钟内完成cell pool的基因型分析。大大加速了筛选流程。对于微量细胞或单克隆，可使用快速裂解试剂盒直接进行PCR，以微量DNA进行快速测序鉴定。

综上所述，基因敲入细胞系的构建依赖于CRISPR/Cas9介导的同源重组修复技术，需要从靶点设计、供体构建、转染条件、修复机制和克隆筛选等方面全方位优化。通过合理利用化学和生物学手段提升HDR效率，同时结合精细的实验流程和高效的筛选鉴定方案，可以显著提高敲入成功率并获得稳定表达的细胞克隆。

四、源井生物CRISPR-U™技术：不仅是基因敲入，更是“高成功率的基因敲入”

源井生物基于自主研发的 CRISPR-U™基因编辑平台 ，在基因敲入项目中形成了体系化的技术优势。该平台结合细胞基因组特性进行靶点精细化设计，搭载源井独有的 gRNA预测算法， 并依托覆盖 1400+细胞参数、10000+编辑案例 的参考数据库，对项目难度、脱靶风险、供体构建策略等关键环节进行系统评估，从设计阶段即提升成功率。凭借CRISPR-U™的技术积累，源井已在 300+ 种细胞系中实施超过10000个基因编辑项目， 广泛应用于基础科研、功能基因研究及药物筛选模型构建。与此同时，源井自研的 “基因型分析小工具” 与 “单克隆基因型鉴定试剂盒（#YK-MV-100）” 能够对cell pool与单克隆进行高通量基因型解析，大幅缩短筛选周期，提升阳性克隆筛出效率。

依托算法、数据库与实验体系的全链条整合，源井生物为科研人员提供 高效率、高准确性、高稳定性的基因敲入一站式解决方案， 助力更多复杂基因编辑项目顺利落地。

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