一文解锁如何快速构建稳定的基因敲除细胞系？

稳定基因敲除细胞系 是基础科研、药物靶点验证及细胞治疗研究的核心工具，其构建效率直接决定项目推进速度与实验可靠性。CRISPR/Cas9等基因编辑技术的普及，虽大幅降低了敲除门槛，但从靶点设计到稳定株验证的全流程仍存在诸多关键节点，任一环节疏漏都可能导致实验延期甚至失败。在本篇文章中，小源将结合实操经验与技术要点，系统拆解快速构建稳定基因敲除细胞系的核心因素，助力科研人员少走弯路。

一、靶点与基因特性的前期评估

前期评估是稳定基因敲除细胞系构建的“前置风控”，决定着项目是否“值得做”，直接规避因基因特性导致的无效投入，核心围绕“目标基因必要性”与“可编辑性”展开。

源井生物EZ-editor™基因编辑工具

评估结果展示

二、sgRNA设计与编辑策略

sgRNA的设计质量是决定基因编辑效率的关键，直接影响靶点切割精度与脱靶风险，合理的编辑策略能进一步提升命中率。

sgRNA设计需遵循三大核心原则：

• 靶向关键功能域
  优先选择基因编码区（CDS）的前1/3区域，尤其是第一、二外显子，确保编辑后引发移码突变，彻底破坏蛋白功能；
• 控制序列特性
  GC含量维持在30%-70%，避免4个以上连续T碱基结尾，5'端优先为G或GG以提升转录效率，同时严格匹配PAM序列（SpCas9常用NGG）；
• 低脱靶风险
  通过CRISPOR、Benchling等工具预测潜在脱靶位点，优先选择特异性评分高的sgRNA。

多sgRNA并行设计是提升命中率的关键策略。 单一sgRNA可能因序列可及性不足导致切割效率低下，同时设计2-3条靶向同一基因不同外显子的sgRNA，通过细胞池筛选（Cell Pool）验证编辑效率， 保留活性最高的靶点 推进后续实验。此外，双sgRNA协同切割策略能实现片段基因删除，进一步提升敲除彻底性。

源井生物依托CRISPR-U™基因编辑平台，搭建了sgRNA设计平台 —— 红棉·CRISPR基因编辑系统 ，结合1400+细胞系的海量敲除数据，优化靶点选择算法，同时采用双sgRNA协同切割与高通量编辑评估体系，使敲除效率较传统方案提升 10-20倍。

红棉·CRISPR基因编辑系统

三、基因编辑方式的选择

基因编辑方式与细胞系的匹配度，直接影响转染效率、细胞活性及实验周期，需结合细胞特性与项目需求精准选择。

细胞系选择是基础

根据实验需要选择合适的细胞系，如果没有指定的细胞系，可以考虑一些常用细胞系如HEK293T、HCT116，这类细胞系转染效率较高、生长速率稳定适配化学转染、电穿孔等多种递送方式；如果是原代细胞、免疫细胞、干细胞等难转染细胞系，需考虑采用病毒介导递送（慢病毒、腺病毒）或RNP递送体系，有助于提升转染效率，但其中一些环节（如载体构建、病毒包装）会使周期延长。此外，需提前验证细胞的药物敏感性，确保筛选标记（嘌呤霉素、潮霉素）的有效浓度，避免浓度过高导致细胞大量死亡。

递送与编辑体系选择需兼顾效率与安全性

建议先通过预实验确定最适合的转染方式，不同转染方式有不同的特点。化学转染适合易转染细胞，操作简便、成本低，周期短；电穿孔递送效率高，适配多数细胞系，但需优化电压、脉冲时间等参数，减少细胞毒性；慢病毒递送可实现稳定整合，适合长期培养，但存在随机整合风险。

源井生物针对不同细胞系特性优化递送方案，灵活采用质粒法、RNP法、病毒法，结合现货载体资源，大幅缩短载体构建与递送周期。

四、单克隆筛选与扩增

多数科研人员面临的核心困境可能是：转染与切割效率达标，但始终无法获得纯合敲除单克隆 ——本质是卡在单克隆筛选环节。 细胞池（Cell Pool）中往往混合纯合敲除、杂合突变及未编辑细胞，若不进行单克隆分离，残留细胞会掩盖敲除表型，导致实验结果波动。

高效筛选需遵循标准化流程

第一步是细胞池富集，转染48-72小时后，通过抗性筛选或荧光报告筛选，淘汰未编辑细胞，提升编辑细胞比例；

第二步是单细胞分离，常用有限稀释法与流式细胞分选（FACS）。

克隆培养与初筛需严控细节

单细胞培养2-3周后，对可见克隆进行编号与低代次传代，避免细胞漂移；提取基因组DNA后，通过PCR扩增+Sanger测序，快速鉴定突变类型，筛选纯合敲除候选克隆。

源井生物通过标准化单克隆筛选流程，结合基因型分析系统一键解析测序结果，大幅缩短初筛周期，同时并行培养多个候选克隆，降低后续验证失败风险。

五、稳定性验证

稳定基因敲除细胞系需满足“多代传代后敲除效果不变”，需从DNA、RNA、蛋白三个层面开展立体验证，避免假阳性结果。

DNA水平验证

通过PCR扩增靶区域并测序，确认纯合敲除基因型稳定，无回复突变；对于多拷贝基因，需确保所有等位基因均发生有效突变。

RNA水平验证

采用RT-qPCR检测靶基因mRNA表达，若出现显著下调且无异常剪接产物，说明突变转录本被无义介导的mRNA降解（NMD）系统清除；若存在异常条带，需通过序列比对确认是否为外显子跳跃产物。

蛋白水平验证

通过Western Blot检测目的蛋白表达，预期野生型条带完全消失，无截短或融合蛋白残留；必要时结合免疫荧光、质谱分析进一步确认。但是蛋白水平验证结果受诸多因素干扰，需要谨慎看待。

此外，需进行长期稳定性验证

将细胞传代后，重复上述验证流程，同时进行STR鉴定与支原体检测，确保细胞身份一致、无污染，最终建立低代次冻存细胞库，为后续实验提供稳定材料。

六、风险控制

基因敲除实验中存在多种潜在风险，尤其是难敲基因、致死基因的处理，合理的风险控制策略能显著提升整体效率。

针对必需基因或高致死风险基因，小源建议可以考虑以下替代策略：

• 额外加添加剂
• 考虑杂合子是否符合实验要求
• 改用RNAi介导的基因敲低
• tet on/tet off 诱导敲除

其他风险应对：
脱靶效应可通过设计特异性sgRNA、设置阴性对照（空载体转染）及全基因组测序验证规避；为防止细胞污染，需在实验全程严格无菌操作，定期检测支原体；敲除不彻底可通过优化sgRNA靶点、采用双sgRNA策略或更换编辑方式解决。

源井生物拥有 8000+KO细胞产品，实现“即买即用”快速交付，同时提供快至4周极速定制服务，结合全流程质控体系，为高风险项目提供专业解决方案。

结语

稳定基因敲除细胞系的快速构建，本质是对从靶点评估、设计编辑再到筛选验证以及风险控制这一全流程的精准把控。从前期规避致死基因风险，到sgRNA设计与编辑方式的优化，再到单克隆筛选与多维度验证的标准化操作，每个环节都需兼顾科学性与实操性。借助源井生物CRISPR-U™平台的技术优势、现货资源与标准化流程，可大幅缩短构建周期、提升成功率，为您科研项目的高效推进提供核心支撑。

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