CRISPR文库高阶应用解析

CRISPR文库高阶应用解析：从顶刊看靶点筛选策略的科学设计

靶点发现一直是基础与转化医学研究中的核心环节。一个关键靶点的识别，往往意味着研究方向的重大突破，也可能是通往高影响力论文的起点。近年来，CRISPR文库筛选作为一种系统性、高通量的功能基因筛选技术，已成为科研人员寻找新靶点、探索疾病机制、开发新药靶标的重要利器。

本文将结合Nature杂志近期一项肺癌转移研究，系统拆解这项CRISPR文库实验的设计思路与技术路径，深入解析如何将文库筛选与疾病模型深度融合，筛出真正具有生物学意义的靶点，助力高分文章产出。

Nature杂志近期一项肺癌转移研究

原位肿瘤在转移过程中，大部分肿瘤细胞会被宿主免疫系统清除，唯有少部分播散性肿瘤细胞（Disseminated Tumor Cells, DTCs）能够逃逸识别，进入远端器官并进入休眠状态。这些休眠细胞通过下调MHC-I及NK细胞识别配体等机制，避免了T细胞与NK细胞的攻击。

一段潜伏后，这些DTCs可能重新进入增殖状态，进入所谓的“转移早期阶段”（incipient metastasis），并最终发展为可检测的转移灶（macrometastasis）。本研究聚焦于识别限制DTC再激活的免疫因子，为理解肿瘤早期转移免疫调控机制提供了重要线索。

图1 肿瘤细胞转移逃逸模型[1,2]

第一步: 定制化 sgRNA 文库设计：小而精的策略

亮点策略: 靶向性强的小型定制文库，精准聚焦免疫通路

• · 文库目标： 探究免疫系统限制转移初期DTCs再激活的关键因子。
• · 设计思路： 围绕免疫识别相关通路选取候选基因，文库覆盖220个目标基因。
• · 三类主要靶点来源：
  • 1. MHC-I/NK配体相关基因（直接影响T细胞/NK识别）
  • 2. 干扰素α/γ及补体系统基因（基于单细胞转录组+GSEA分析获得）
  • 3.STING、RNA识别、LPS相关信号通路基因（干扰素信号上游）。

每基因设计5条sgRNA，构建为多个亚文库（每库约20个基因），保障代表性与技术可控性。

第二步：文库转导与细胞准备：高代表性建库策略

· 细胞系： 人肺腺癌细胞系 H2087-LCC 与 KPad1

· 转导方式： 慢病毒感染，MOI = 0.3，覆盖度 >1000x

· 筛选方式： >嘌呤霉素（2.5 μg/mL）筛选4天，获得稳定表达文库的细胞库

第三步：体内筛选设计：免疫模型联合流式分选

亮点策略： 体内模型模拟免疫逃逸过程 + 荧光分选靶细胞

• · 小鼠模型： 免疫缺陷小鼠（允许肿瘤细胞迅速扩增）
• · 注射方式： 心脏/尾静脉注射，建立多器官转移模型
• · 分组设计：
  • 1. 对照组： 转移初期休眠状态DTCs
  • 2. 实验组： 已激活扩增形成微转移灶的细胞
• · 分选方式: 活体成像追踪 + 荧光标记肿瘤细胞流式分选

图2 CRISPR文库筛选流程图[1]

第四步：NGS测序与生信分析：双模型交叉验证靶点

· 分析逻辑： 实验组与对照组之间sgRNA富集度差异

· 关键结果： MHC-I及NK配体相关sgRNA在实验组中显著富集

· 双细胞模型验证： H2087-LCC 与 KPad1中均识别出STING信号通路为共同靶点

· 分析工具： MAGeCK / edgeR / GSEA等主流方法进行差异sgRNA筛选与通路富集分析

图3 生信分析筛选靶点[1]
A. H2087-LCC细胞注射组，不同组织中sgRNA富集程度；B. Kpad1细胞注射组，不同组织中sgRNA富集程度；C. 上述两组细胞的sgRNA富集分析。

第五步：靶点验证：从表达水平到功能实验证实关键基因作用

· STING表达检测： 免疫荧光证实其在转移早期阶段上调

· 功能实验：

• 1. STING敲除 → 转移灶加速扩增
• 2. STING过表达 → 抑制早期肿瘤细胞的增殖再激活

该实验从文库构建到体内功能验证实现了“闭环筛选”，完整阐明了STING通路在抑制DTC再激活中的核心作用。

图四 STING靶点验证[1]
A&B. 两种细胞中STING信号强度对比。相较于休眠期细胞（Ki67low），转移初期细胞（Ki67high）的STING信号显著增加；C. 敲除KPad1细胞中Sting基因后，肿瘤细胞增殖显著增加；D. Tet-On系统过表达Sting基因后，肿瘤细胞增殖被显著抑制；E. 敲除Sting基因后，各器官中的肿瘤细胞均明显增殖。

· 与单细胞组学结合：通过scRNA-seq辅助候选基因筛选，构建更精细化文库；

· 多模态筛选平台：将CRISPR筛选与药物刺激、高通量显微成像、AI分析结合；

· 疾病微环境模拟：更多体内CRISPR文库筛选（如肿瘤免疫微环境、小鼠人源化模型）；

· 功能机制延伸：从靶点筛选进一步探究下游信号网络与调控轴，推动机制研究；

· CRISPRa/i 多通路联合筛选：筛选激活/抑制通路潜在组合靶点，用于联合用药开发;

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参考文献

[1] Hu, J., Sánchez-Rivera, F.J., Wang, Z. et al. STING inhibits the reactivation of dormant metastasis in lung adenocarcinoma. Nature 616, 806–813 (2023).
[2] Laughney, A.M., Hu, J., Campbell, N.R. et al. Regenerative lineages and immune-mediated pruning in lung cancer metastasis. Nat Med 26, 259–269 (2020).