ZNF432基因敲除U2OS细胞助力发现卵巢癌耐药相关因子

ZNF432基因敲除U2OS细胞助力发现卵巢癌耐药相关因子

最近ZNF蛋白被证实为调节哺乳动物细胞基因组完整性的关键因子。为探究ZFP可作为基于同源重组(HR)的DNA修复效应器的可能性，拉瓦尔大学Jean-Yves Masson团队采用源井构建的U2OS敲除ZNF432细胞系进行了一系列实验，发现ZNF432在癌细胞中缺失会加速DNA修复，导致PARPi作用减弱，使卵巢癌细胞产生耐药性，证实ZNF432是一种新的HR抑制因子，成功拓宽了研究PARPi疗效的新途径^[1]。该题为ZNF432 stimulates PARylation and inhibits DNA resection to balance PARPi sensitivity and resistance的文章被发表在Nucleic Acids Research(IF=14.9)上。

多聚ADP-核糖基化修饰（PARylation）已经证实协调参与DNA损伤反应，并与DNA修复相关。为了找到影响DNA双链断裂(DSB)修复的PAR相关基因，作者选择了7个被鉴定为PAR结合蛋白的ZFPs来评估它们在同源重组修复（HR）中的潜在作用。在筛选前实验中，对每个ZFP靶点进行siRNA诱导的基因沉默，ZNF432表现出最显著的效果(图1)。之后作者使用源井CRISPR-U™技术敲除U2OS细胞中的ZNF432，发现参与DNA修复过程的RAD51和BrdU蛋白表达量提高，显著增加了pRPA的积累，证实ZNF432是一种新的DDR因子，有助于HR介导的DSB修复。

图1分析鉴定ZFPs中潜在的DDR调节因子

ZNF432具有KRAB结构域和由16个重复序列组成的锌指 (ZNF) 结构域，目前已鉴定出5个丝氨酸PARylation位点，其中3个位于ZNF结构域(图2)。KRAB通过与TRIM28 / KAP1相互作用于核质中的蛋白，而ZNFs则均匀地作用于整个细胞核中的蛋白。KAP1-KRAB-ZNFs的协同活性会使KRAB-ZFPs发生精确的核质定位，且证明了ZNF432会重新定位到受损部位，参与DNA的修复过程。在293T细胞中表达KRAB和ZNFs的GFP融合蛋白，并使用微红外监测，这两个结构域都以核蛋白的形式表达。比较了正常条件下GFP-ZNF432与BMN673抑制PARP和PRP-1敲除细胞中GFP-ZNF432的富集动态。发现GFP-ZNF432在激光诱导的DSB中的定位依赖于PAR。

图2 ZNF432对DNA修复的抑制依赖于PARP-1和PAR的合成

DNA损伤反应（DDR）蛋白对DNA损伤通常仅依赖于PAR诱导的染色质重塑，为了进一步讨论PAR对ZNF432 DNA损伤位点的反应，激光诱导实验发现ZNF432结合在PAR外(图3)。krabb相关蛋白被确认是HEK293T细胞中与ZNF432相互作用的蛋白之一，表明蛋白之间存在强大的混杂相互作用。使用PARP-1缺失的细胞，观察到KAP1-ZNF432蛋白复合物十分稳定，并且在缺乏PARP-1或PARP-1激活后不会解离。PARP-1被激活后，数百种蛋白质在ZNF432蛋白相互作用网络中被鉴定出来，这些结果表明在PARP-1诱导的时，ZNF432相互作用蛋白的组装可以被重塑，进一步支持了ZNF432通过PARP-1依赖性途径调节DDR。利用ZNF432的KO细胞，与过表达细胞相比，观察到PARylation表达量下降，进一步验证了PARP-1的激活是导致DNA损伤信号传导和修复中最关键的步骤之一。

图3 ZNF432与PAR和PARP-1的相互作用

由于HR缺陷的肿瘤细胞对PARPi高度敏感，因此作者通过ZNF432耗竭恢复这些细胞中的HR来评估是否会导致PARPi耐药，首先观察到ZNF432表达量的减弱促进了U2OS细胞对PARPi的抗性(图4)，后续通过回补实验恢复了PARPi的敏感性。

对卵巢癌组织样本进行基因表达分析，发现与正常卵巢样本相比，卵巢癌样本中ZNF432的总体表达水平较低。与健康人群相比，子宫内膜异位症卵巢癌患者中ZNF432的表达明显降低，更多样本分析表明，调节卵巢癌细胞中ZNF432的表达可以使卵巢癌细胞对PARPi敏感。选择卵巢癌细胞系COV362和耐药株COV362-R进一步评估ZNF432过表达在高级浆液性卵巢癌细胞模型中的影响，发现ZNF432的过表达使COV362和COV362-R细胞对药物具有敏感性，而敲低会对药物产生抗性。

图4调控ZNF432表达量影响卵巢癌细胞耐药性

在这项研究中，作者报道了ZNF蛋白ZNF432作为PAR读取器调节DNA损伤反应的新作用，细胞系统中ZNF432的缺失会导致对PARP抑制剂的耐药性。综上，作者的研究结果支持了一个新兴的概念，含ZNF的蛋白可以调节PARPi的磷酸化，ZNF432是一种新的HR抑制因子，参与细胞对DNA破坏和PARPi的反应，该研究为卵巢癌预后提供了重要价值。

参考文献：

[1] O’Sullivan J, Kothari C, Caron M C, et al. ZNF432 stimulates PARylation and inhibits DNA resection to balance PARPi sensitivity and resistance[J]. Nucleic Acids Research, 2023, 51(20): 11056-11079.