ZNF432基因敲除U2OS细胞助力发现卵巢癌耐药相关因子

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ZNF432基因敲除U2OS细胞助力发现卵巢癌耐药相关因子

ZNF432基因敲除U2OS细胞助力发现卵巢癌耐药相关因子 

最近ZNF蛋白被证实为调节哺乳动物细胞基因组完整性的关键因子为探究ZFP可作为基于同源重组(HR)的DNA修复效应器的可能性,拉瓦尔大学Jean-Yves Masson团队采用源井构建的U2OS敲除ZNF432细胞进行了一系列实验,发现ZNF432在癌细胞中缺失会加速DNA修复,导致PARPi作用减弱,使卵巢癌细胞产生耐药性,证实ZNF432是一种新的HR抑制因子,成功拓宽了研究PARPi疗效的新途径[1]。该题为ZNF432 stimulates PARylation and inhibits DNA resection to balance PARPi sensitivity and resistance文章被发表在Nucleic Acids Research(IF=14.9)上。

多聚ADP-核糖基化修饰(PARylation已经证实协调参与DNA损伤反应,DNA修复相关。为了找到影响DNA双链断裂(DSB)修复的PAR相关基因作者选择了7个被鉴定为PAR结合蛋白的ZFPs来评估它们在同源重组修复(HR中的潜在作用在筛选前实验中,对每个ZFP靶点进行siRNA诱导的基因沉默ZNF432表现出最显著的效果(图1)。之后作者使用源井CRISPR-U™技术敲除U2OS细胞中的ZNF432发现参与DNA修复过程的RAD51BrdU蛋白表达量提高,显著增加了pRPA的积累,证实ZNF432是一种新的DDR因子,有助于HR介导的DSB修复

分析鉴定ZFPs中潜在的DDR调节因子 

1分析鉴定ZFPs中潜在的DDR调节因子

ZNF432具有KRAB结构域和由16个重复序列组成的锌指 (ZNF) 结构域目前已鉴定出5个丝氨酸PARylation位点,其中3个位于ZNF结构域(图2)。KRAB通过与TRIM28 / KAP1相互作用于核质中的蛋白,而ZNFs则均匀地作用于整个细胞核中的蛋白。KAP1-KRAB-ZNFs的协同活性会使KRAB-ZFPs发生精确的核质定位证明了ZNF432重新定位到受损部位参与DNA的修复过程。在293T细胞中表达KRAB和ZNFsGFP融合蛋白,并使用微红外监测,这两个结构域都以核蛋白的形式表达比较了正常条件下GFP-ZNF432与BMN673抑制PARP和PRP-1敲除细胞中GFP-ZNF432的富集动态。发现GFP-ZNF432在激光诱导的DSB中的定位依赖于PAR。

 ZNF432对DNA修复的抑制依赖于PARP-1和PAR的合成

2 ZNF432对DNA修复的抑制依赖于PARP-1和PAR的合成

DNA损伤反应(DDR蛋白对DNA损伤通常仅依赖于PAR诱导的染色质重塑为了进一步讨论PAR对ZNF432 DNA损伤位点的反应激光诱导实验发现ZNF432结合PAR外(图3)。krabb相关蛋白被确认是HEK293T细胞中ZNF432相互作用蛋白之一表明蛋白之间存在强大的混杂相互作用。使用PARP-1缺失的细胞,观察到KAP1-ZNF432蛋白复合物十分稳定,并且在缺乏PARP-1或PARP-1激活后不会解离。PARP-1激活后,数百种蛋白质在ZNF432蛋白相互作用网络中被鉴定出来,这些结果表明在PARP-1诱导的ZNF432相互作用蛋白的组装可以被重塑进一步支持了ZNF432通过PARP-1依赖性途径调节DDR利用ZNF432KO细胞,与过表达细胞相比,观察到PARylation表达量下降,进一步验证了PARP-1的激活是导致DNA损伤信号传导和修复中最关键的步骤之一

 

ZNF432与PAR和PARP-1的相互作用 

3 ZNF432与PAR和PARP-1相互作用

由于HR缺陷的肿瘤细胞对PARPi高度敏感,因此作者通过ZNF432耗竭恢复这些细胞中的HR来评估是否会导致PARPi耐药,首先观察到ZNF432表达量的减弱促进了U2OS细胞对PARPi的抗性(图4)后续通过回补实验恢复了PARPi的敏感性

卵巢癌组织样本进行基因表达分析,发现与正常卵巢样本相比,卵巢癌样本中ZNF432的总体表达水平较低与健康人群相比,子宫内膜异位症卵巢癌患者中ZNF432的表达明显降低更多样本分析表明,调节卵巢癌细胞中ZNF432的表达可以使卵巢癌细胞对PARPi敏感选择卵巢癌细胞系COV362和耐药株COV362-R进一步评估ZNF432过表达在高级浆液性卵巢癌细胞模型中的影响发现ZNF432的过表达使COV362和COV362-R细胞对药物具有敏感性而敲低会对药物产生抗性

 

调控ZNF432表达量影响卵巢癌细胞耐药性 

4调控ZNF432表达量影响卵巢癌细胞耐药性

在这项研究中,作者报道了ZNF蛋白ZNF432作为PAR读取器调节DNA损伤反应的新作用细胞系统中ZNF432的缺失导致对PARP抑制剂的耐药性。综上作者的研究结果支持了一个新兴的概念,含ZNF的蛋白可以调节PARPi的磷酸化ZNF432是一种新的HR抑制因子,参与细胞对DNA破坏和PARPi的反应该研究为卵巢癌预后提供了重要价值

 

参考文献:

[1] O’Sullivan J, Kothari C, Caron M C, et al. ZNF432 stimulates PARylation and inhibits DNA resection to balance PARPi sensitivity and resistance[J]. Nucleic Acids Research, 2023, 51(20): 11056-11079.

 

 

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