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1、技术原理:
前面提到DNA双链断裂后,细胞除了NHEJ修复,还可以进行同源介导的修复(Homology Directed Repair, HDR),点突变和基因敲入稳转株就是利用HDR的原理构建的。通过合成或构建携带靶位点两端同源臂及目的片段的Donor oligo或Donor vector,与gRNA和Cas9质粒共电转,通过HDR方式,Donor的同源臂与靶位点发生同源重组,Donor携带的点突变、标签或者报告基因等重组到基因组特定位点。
2、技术优势:
① 源井生物采用质粒电转法构建点突变或基因敲入稳转细胞株,与慢病毒法相比,无病毒骨架的随机整合,风险大大降低。
② 实验前进行严格的预实验(包括验证细胞单克隆形成率,最佳电转效率条件摸索,细胞最小全致死浓度,靶位点附近序列验证等),提高项目一次通过率,大大缩短实验周期。
3、质量控制:
阳性克隆株经过PCR扩增及测序验证无误后交付。
4、应用:
基因标记,示踪目的基因;对目的基因进行精确突变;基因组定点过表达等。