膜蛋白CRISPR文库：如何用它实现相关靶点筛选？

膜蛋白CRISPR文库：如何用它实现相关靶点筛选？

膜蛋白分布于各种细胞和细胞器的胞膜，约占人类蛋白质组的25%，对细胞和外界环境以及细胞间的信号转导起重要作用；膜蛋白表达失调对肿瘤的发生、发展，肿瘤细胞增殖、转移等过程具有重要作用，是当今药物研发和基础科研的重要靶点。CRISPR文库由于其成本低、高通量、可重复性好等特点，被广泛用于靶点筛选，那么使用膜蛋白文库进行筛选又能找到哪些潜在的疾病治疗靶点呢？

1. 鼠膜蛋白激活文库筛选发现促肿瘤细胞转移靶点Lrrn4cl

黑色素瘤在所有皮肤恶性肿瘤中占比约5%，但是由于其易转移的特点，致死率高达70%以上。为了寻找出黑色素瘤转移相关基因，Adams等人使用小鼠膜蛋白激活文库构建B16-F0文库细胞，并通过尾静脉注射入裸鼠后，于第19天收集肺转移肿瘤细胞（图1）。经NGS测序分析肺转移肿瘤组织与对照组sgRNA差异，研究者发现Lrrn4cl基因被显著富集^[1]（表1）。

图1 小鼠膜蛋白激活文库筛选促进肿瘤细胞肺转移基因^[1]

表1 肺肿瘤组织中sgRNA富集分析^[1] 

为了确认Lrrn4cl基因促进肿瘤转移的作用，研究者们在三种不同的小鼠黑色素瘤细胞系（图2 a）以及另外三种不同肿瘤细胞系（图2 b）中分别过表达该基因后，发现这些细胞的肺转移定植能力均显著上调。除此之外，使用膜蛋白激活文库对E0771-dCas9细胞进行筛选后，富集程度最高的同样是Lrrn4cl基因（数据未展示），进一步说明该基因对肿瘤细胞肺转移定植的重要性。 

图2 不同细胞系中过表达Lrrn4cl基因均能促进其肺转移定植能力^[1]

2. 人膜蛋白激活文库筛选发现TMX2促进HCC细胞增殖

原发性肝癌是第六大常见癌症类型，也是导致癌症相关死亡的第三大原因。作为原发性肝癌的主要组织学类型，肝细胞癌（HCC）占肝癌诊断和死亡的绝大多数。Zhang等人使用人膜蛋白激活文库感染HCC细胞后，持续对其进行传代培养，并比较D1和D14天文库细胞中sgRNA差异^[2]（图3）。

图3 人膜蛋白激活文库筛选促HCC细胞增殖基因^[2] 

分析发现TMX2基因在正向筛选中显著富集；同时，一项使用全基因组敲除文库筛选HCC细胞的研究中，TMX2基因在负向筛选中也被显著富集^[3]（图4）。这些结果说明TMX2可能在HCC细胞活力中发挥关键作用。

图4 TMX2基因被显著富集^[2]

为了确认TMX2基因对HCC细胞活力的影响，研究者在不同的HCC细胞系中进行了基因敲低和过表达实验，发现TMX2基因敲低后HCC细胞的克隆形成能力显著降低，而过表达则会显著增加HCC细胞的增殖能力（图5）。

图5 不同HCC细胞中敲低或过表达TMX2基因^[2]

进一步探究TMX2基因促进HCC细胞增殖的机制，研究者们通过比较TCGA（The Cancer Genome Altas Program）数据库中TMX2高表达和低表达样本间差异，发现TMX2高表达样本中，与自噬相关基因明显富集。通过RT-qPCR检测也发现，敲低TMX2基因后，自噬相关基因表达量均显著下调（图6）。

图6 TMX2基因调控细胞自噬水平^[2]

通过co-IP，免疫荧光等实验深入研究TMX2调控自噬的机制，发现TMX2通过调控KPNB1蛋白的核质比来调节细胞自噬（图7）。

图7 TMX2通过调控KPNB1蛋白的核质比来调节细胞自噬^[2]

参考文献

[1] van der Weyden L, Harle V, Turner G, Offord V, Iyer V, Droop A, Swiatkowska A, Rabbie R, Campbell AD, Sansom OJ, Pardo M, Choudhary JS, Ferreira I, Tullett M, Arends MJ, Speak AO, Adams DJ. CRISPR activation screen in mice identifies novel membrane proteins enhancing pulmonary metastatic colonisation. Commun Biol. 2021 Mar 23;4(1):395.

[2] Zhang W, Tang Y, Yang P, Chen Y, Xu Z, Qi C, Huang H, Liu R, Qin H, Ke H, Huang C, Xu F, Pang P, Zhao Z, Shan H, Xiao F. TMX2 potentiates cell viability of hepatocellular carcinoma by promoting autophagy and mitophagy. Autophagy. 2024 Oct;20(10):2146-2163.

[3] Meyers RM, Bryan JG, McFarland JM, Weir BA, Sizemore AE, Xu H, Dharia NV, Montgomery PG, Cowley GS, Pantel S, Goodale A, Lee Y, Ali LD, Jiang G, Lubonja R, Harrington WF, Strickland M, Wu T, Hawes DC, Zhivich VA, Wyatt MR, Kalani Z, Chang JJ, Okamoto M, Stegmaier K, Golub TR, Boehm JS, Vazquez F, Root DE, Hahn WC, Tsherniak A. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nat Genet. 2017 Dec;49(12):1779-1784.