ANXA2基因敲除细胞系——助力研究肿瘤的发生发展

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ANXA2基因敲除细胞系——助力研究肿瘤的发生发展

膜联蛋白A2(annexin A2,ANXA2)基因位于15号染色体,由339个氨基酸组成,其大小为36kDa其编码的蛋白是膜联蛋白家族的重要成员,是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白,广泛存在于植物和动物中。很多细胞都可以产生ANXA2包括血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、滋养层细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等。ANXA2可以在细胞质中以游离的单体存在,可以与细胞内膜结合,或者依附于质膜的外表面。主要是参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动包括胞吐作用中的膜融合、囊泡运输、细胞黏附、细胞增殖、凋亡、复制、信号传导以及离子通道的形成

近年来大量的研究已经证实,ANXA2的表达失调与多种肿瘤的发生发展密切相关,其表达在人类绝大多数肿瘤中均上调,这种过表达现象与肿瘤的发生,发展,浸润,转移及预后差等密切相关。而细胞骨架在细胞运动,迁移以及维持细胞形态稳定中起着非常重要的作用。

 

ANXA2对人结直肠癌细胞行为的调节作用研究

有报道显示,ANXA2与肌动蛋白F-Actin等骨架蛋白以及多种与细胞骨架变构、运动相关的调节因子相互作用,从而影响肿瘤细胞的恶性行为。因此为了确切地揭示ANXA2在肿瘤特别是结直肠癌的发展过程中的作用,研究人员以人结直肠癌细胞系Caco2为靶细胞,对该细胞的ANXA2基因进行了敲除,获得了ANXA2-/-Caco2细胞系,以野生型Caco2细胞(ANXA2+/+Caco2)为对照,研究了ANXA2基因的表达对癌细胞的生长、运动、凋亡的影响。结果发现:敲除ANXA2基因后,扫描电镜结果显示,caco2细胞表面的丝状伪足生长缓慢,微绒毛明显变细变少;透射电镜结果显示,ANXA2-/-caco2细胞内可见更多的染色质凝集、线粒体减少、核膜解聚;野生型caco2细胞的F-actin沿着质膜内表面和胞质密集的分布,而ANXA2-/-caco2细胞中F-actin沿着质膜和胞质内的分布明显减少,β-tubulin在胞质内的分布减少,但差异不明显;野生型caco2细胞的laminB在细胞核膜内侧密集的分布,而ANXA2-/-caco2细胞中laminB在胞核膜内侧的分布明显减少。构建ANXA2 KO细胞系离不开高效的敲除载体,源井ANXA2 gRNA敲除载体能很好地满足实验需求。除此以外,库内还有超10000种现货载体,感兴趣的话欢迎点击查看>>

由此得出结论:ANXA2与人结直肠癌caco2细胞的生长、增殖、凋亡及运动力密切相关,抑制ANXA2的表达可抑制caco2细胞的增殖力和体外迁移能力,促进细胞凋亡。


构建ANXA2 KO CHO细胞系评估敲除对降低HCP污染的影响。

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞常被当作宿主细胞,用于生产一系列重组治疗蛋白,包括单克隆抗体和fc融合蛋白。这生产过程中,由于宿主细胞蛋白(HCP)对免疫原性有潜在风险,因此必须从治疗配方中去除。虽然大多数HCP杂质可以在典型的下游净化过程中有效去除,但清除少量HCP仍然具有挑战性。

研究人员利用CRISPR/Cas9系统,成功构建了ANXA2和ctsd敲除的CHO细胞株,以评估敲除方法降低HCP污染风险的可行性。实验结果证实了在细胞裂解液中完全消除了相应的HCP。重要的是,在8天的培养过程中,所有的敲除细胞株都显示出与野生型对照相似的生长和活力。因此,敲除不必要的基因可以减少HCP对重组治疗蛋白生产的污染。然而,确定基因敲除对这类细胞系产量的影响还有待进一步研究。

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构建ANXA2基因敲除MDCK细胞系验证ε毒素在MDCK细胞表面的受体。

研究人员根据CRISPR/Cas9靶点设计原则设计靶点,构建PALentiCRISPR v2重组质粒。并将构建好的质粒转染至MDCK细胞中,用嘌呤霉素筛选敲除ANXA2蛋白的MDCK细胞株,通过细胞毒性试验验证MDCK细胞膜表面的ANXA2蛋白是否为ε毒素的受体蛋白。细胞毒性试验结果表明,敲除ANXA2基因并不能减弱ε毒素对MDCK细胞的毒性。说明了ANXA2蛋白不是ε毒素在MDCK细胞表面的受体。研究结果为今后MDCK细胞其他蛋白的敲除提供了试验方法,构建的ANXA2基因敲除的MDCK细胞也为ANXA2蛋白引起的其他疾病的研究奠定了基础。如果您对此感兴趣,源井可提供多种MDCK细胞,包括KO/野生型/Cas9/Luc细胞等,欢迎点击了解>>


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参考文献:

[1] 林枝云,宋英,何巍,戴海斌.膜联蛋白A2的结构、功能及其在疾病中的研究进展[J].中国现代应用药学,2016,33(10):1350-1354.

[2] 崔婷婷. ANXA2敲除对结肠癌caco2细胞运动相关形态的研究[D].陕西师范大学,2012.

[3] Fukuda Nobuo,Senga Yukako,Honda Shinya. Anxa2- and Ctsd-knockout CHO cell lines to diminish the risk of contamination with host cell proteins.[J]. Biotechnology progress,2019,35(4):

[4] 黄静,高洁,夏苏苏,金志颖,康琳,高姗,杨浩,辛文文,赵宝华,王景林.Annexin A2基因敲除MDCK细胞系的构建[J].动物医学进展,2019,40 (05):13-17.DOI:10.16437 /j.cnki.1007-5038.2019.05.003.

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