HeLa细胞的引入

与其他细胞系一样，HeLa细胞被称为科学研究中的永生细胞系，只要它们在适当的环境中维持和维持，它就可以在实验室细胞培养板中无限次分裂。它通常用于基因编辑研究，其中HeLa细胞成为CRISPR/Cas9 基因敲除细胞系。

HeLa细胞是最古老，最常用的人类细胞系，也是最常用的CRISPR细胞系。该细胞系起源于1951年一名31岁的非洲裔美国妇女的子宫颈癌细胞。观察到该细胞系的细胞生长非常快，每20-24小时就会翻一番，这与之前死亡的其他标本不同。发现该细胞系非常耐用和多产，这使其广泛用于科学研究，例如HeLa细胞的基因敲除。

HeLa细胞的应用

自从1953年HeLa细胞成为第一个成功克隆的人类细胞以来，它们一直被用于癌症，艾滋病，放射线和有毒物质的影响，基因作图以及无数其他科学追求的研究。例如，乔纳斯·索克（Jonas Salk）使用HeLa细胞测试了1950年代的第一种脊髓灰质炎疫苗，这使得HeLa细胞非常适合脊髓灰质炎疫苗测试，因为可以轻松获得结果。此外，HeLa细胞还有助于人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的开发。

1965年，亨利·哈里斯（Henry Harris）和约翰·沃特金斯（John Watkins）通过将HeLa细胞与小鼠胚胎细胞融合，创建了第一个人-动物杂交体。这使得将基因定位到特定染色体方面的进展成为可能，这最终导致了人类基因组计划，涉及CRISPR技术的基因敲除和基因敲入。

1）通过CRISPR/Cas9建立SQSTM1/p62基因敲除Hela细胞

为了探索针对p62双重sgRNA的CRISPR / Cas9基因编辑的效率，研究人员成功地使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了p62基因。还应用细胞稀释法和嘌呤霉素筛选来分别确认双sgRNA和单sgRNA指导的基因编辑的成功率。蛋白质印迹分析表明，双sgRNA定向的p62基因敲除效率高于单sgRNA定向的基因敲除效率。靶序列测序分析表明，编码p62的基因具有大的缺失突变。 H2O2处理后稳定敲除Hela细胞系的结果表明，p62基因敲除可显着抑制H2O2诱导Hela细胞早期凋亡。因此，已经成功建立了p62敲除Hela细胞系。双重sgRNA引导的CRISPR/ Cas9基因编辑系统可能是更有效的编辑工具。

2）使用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建稳定的Cdc25C敲除HeLa细胞株

使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人宫颈癌细胞HeLa中的细胞分裂周期25同源C（Cdc25C）基因，以稳转细胞构建的Cdc25C基因敲除细胞系。该方法基于CRISPR/Cas9目标设计规则，在上游和下游设计可特异性识别Cdc25C基因第一个外显子相关序列的小指导RNA（sgRNA），构建真核重组表达质粒。经过测序和鉴定后，将重组质粒转染到HeLa细胞中，使用嘌呤霉素（puromycin）耐药性筛选来稳定敲除Cdc25C基因细胞系，然后使用Western印迹法鉴定Cdc25C敲除效果。最后，流式细胞仪用于检测基因敲除对细胞周期的影响。结果筛选出具有稳定敲除Cdc25C基因的细胞系，Cdc25C敲除显着影响了G2 / M期过程。结论利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源性Cdc25C基因敲除细胞系，研究了Cdc25C在细胞周期过程中的功能，为相关癌症的发生奠定了基础。

基因敲除切割效率不仅可以让人具有生成蛋白基化谱和建立调控记录的能力，而且具有多种优势，是一种特别有吸引力的重组蛋白表达系统。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作简单，通过瞬时基因表达可以快速产生重组蛋白。第三，可用于稳定的重组蛋白生产。一些研究人员利用基因敲除切割效率系统产生基因编辑细胞系，对GLUL基因组位点进行靶向测序，产生EPO的稳转细胞系，并发现重组促红细胞生成素在人体内稳定表达的机制。

源井生物根据客户需求，结合靶基因的情况进行基因稳转敲除方案设计。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA设在外显子2两端的内含子中，敲除外显子编码碱基数为非3倍数，敲除后可造成移码。

方案2：移码基因敲除方案，gRNA设在外显子上，缺失的碱基数为非3倍数，敲除后可发生移码突变。

方案3：大片段基因敲除方案，将整个基因的编码序列敲除，达到大片段敲除的效果。

Reference:

5 Contributions HeLa Cells Have Made to Science. Cell Science from Technology Networks. Retrieved 2020-03-25.Yao Ye-bao, Wang Guang-fei, Dong Qing-cai, Cao Cheng. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system, Military Medical Sciences, 2019,42(1):1-5.Huang Rongfu, Peng Weilin, Lin Jiansheng, Lian Jianfeng, Yang Xiaoyu, Zheng Ming. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system. Military Medical Sciences, 2017,41(5):359-362